j酵母双杂交课件

1、学院：医药学院学院：医药学院专业：微生物与生化药学专业：微生物与生化药学学号：学号：21140811040姓名：崔小清姓名：崔小清 相关知识： 在结构基因的上游、下游或内部有一些调控成分，并依靠特定的蛋白因子结合与否调控基因的转录。1、顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，作用是参与基因表达的调控。2、反式作用因子（转录因子）：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。3、报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。基本原理基本原理真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的、功能上也相互

2、独立的真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成的结构域：结构域组成的结构域：转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain) DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain) 转录激活因子转录激活因子 两个结构域分开时仍具有功能，但不能激活转录，只有他们以适当 途径在空间上较为接近时，才能具有转录因子活性，激活报告基因的表达。（可为不同转录因子的BD和AD） 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白-蛋白的相互作用。酵母双杂交原理示意图XRNAPolymeraseDBDReporter gene

3、PreyBaitADYExpressionUAS啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：实验发现：转录表达转录表达DNA binding domainActive domain上游激活序列（上游

4、激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分分开，就开，就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与分别与两个不同的多肽连接。两个不同的多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：通过效应基因是否被激活来检查：上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白

5、蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白BGAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。不能转录不能转录上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录GAL4的的DB domain与与AD Domain也能也能靠近，所以能启动效应基因的转录。靠近，所以能启动效应基因的转录。转录表达转录表达实验步骤实验步骤一、构建双杂交体系的宿主菌一、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型GA

6、L4基因，使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。二、构建报告基因（reporter gene） GAL4的效应基因是his3。 GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。三、构建双杂交体系的穿梭质粒 1. 穿梭质粒（shuttle plasmid）：既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒： 分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。（1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 筛选标志：TRP 蛋白B基因按正确阅读框按正确阅读框 克隆到克隆到GAL4的的AD片断片

7、断 之后。之后。 筛选标志：筛选标志：LEU2 接合型酵母细胞接合型酵母细胞cDNA文库文库 诱铒蛋白基因诱铒蛋白基因多克隆位点多克隆位点DNA-BD 载体载体 AD 载体载体转化转化转化转化a接合型酵母细胞接合型酵母细胞筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔筛选平板筛选平板生长菌苔生长菌苔同一个三重筛选平板同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定鉴定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分已部分已商品化商品化3. 两种重组质粒共同转化酵母菌两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）4. 筛选观察筛选观察 双载体转化能合成亮氨酸和色氨酸，Trp-Leu-菌体存活。Trp- -Le

8、u- -3. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）4. 筛选观察 筛选蛋白筛选蛋白A和蛋白和蛋白B能相能相互作用的双载体转化子。互作用的双载体转化子。Trp- -Leu- -His- -注意事项注意事项1、蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。2、融合蛋白的表达对细胞有毒性，应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体3、某些诱饵蛋白具有自身激活性质。双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域4、避免细菌污染。 尤其在以YPDA培养时，酵母培养物易于受细菌污染。可以通过培养物气味、生长速度和培养物沉降系数简易鉴别。细菌污染时，培养物带有臭味，而酵母培养物略有酒香味。细菌生长速

9、度远较酵母为快，一旦发现OD600增长过快，应考虑细菌污染。5、要使用独立的称量药勺称取不同培养基组分，防止交叉污染，以免营养筛选效果不佳。6、控制好各步骤中菌体的OD值，转接大瓶后才能较快生长。7、酵母培养不能使用尖底容器。酵母比重较大，在震荡培养过程中，易于沉积于培养容器底部，因而尖底管不适合用于酵母培养。如1.5mlEP管，15ml离心管等。尽量使用2ml圆底EP管，50ml离心管等。应用范围应用范围1、高灵敏度地检测蛋白-蛋白的相互作用2、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白3、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽4.、确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变

10、再进行双杂交。5、寻找与调控蛋白相互作用的化合物6、蛋白质相互作用图谱的绘制7、利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能8、用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用 的传 递途径，发现新基因。 9、分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛 的已知基因推测新基因功能。 FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管病变的发生有关。筛选人胎脑 cDNA 文库中与FAM172A 蛋白相互作用的蛋白，为深入研究新发现的蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改变了细胞周期的分布，

11、促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增殖而促进细胞的生长。 构建 p GB-FAM172A诱饵质粒，转化酵母菌株 Y190。人胎脑 cDNA 转化诱饵酵母菌，于营养缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生长，从中筛选到 35个单克隆进行 - 半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验，对蓝色克隆者进行质粒抽提，转入大肠杆菌 DH/OB，进行抗性筛选，从中提取质粒，一对一与诱饵质粒 p GB-FAM172A共转酵母细胞 Y190 ，进行验证鉴定，提取质粒 DNA, 进行

12、测序并进行 BLAST 比对分析。结果成功构建 p GB-FAM172A质粒，经严格筛选，共有10个阳性克隆，分别进行测序、序列比对，成功筛选出6个与 FAM172A，存在相互作用的蛋白: RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2。具体事例具体事例应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究1、材料酵母菌株 Y190，人胎脑 cDNA文库（载体是PACT2），E.coli DH/OB，酵母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。2、主要试剂和试剂盒营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal

13、，Sfi 限制性内切酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回收试剂盒，PCR产物回收试剂盒3、实验步骤（1）诱饵质粒构建：扩增质粒：PDC315-FAM172A质料为模板，Sfi 酶切获取诱饵基因片段连接： T4DNA连接酶与p GB-Vector连接重组载体鉴定: 重组载体转化E.coli DH/OB ，涂布于Kan平板过夜挑取 单克隆摇菌过夜培养，提取质粒，用质粒作模板 PCR 扩增，产物琼脂糖凝胶电泳，并经酶切及测序鉴定，确定 FAM172A读码框序列是否正确。（2）转化酵母菌株Y190采用 PEG 转化法将诱饵质粒 p GB-FAM172A转入

14、酵母菌株 Y190，同时设质粒 p GB为阴性对照，质粒 PCL1 为阳性对照，检测诱饵蛋白对 LacZ报告基因是否存在转录激活作用，若转化了诱饵质粒的酵母菌落表达 -半乳糖苷酶，则可使底物 X-gal 变蓝，说明存在自激活，否则说明无自激活。（3）酵母双杂交筛选人胎脑 cDNA 文库，人胎脑 cDNA文库转化诱饵酵母菌及初步筛选: 菌液，分别涂布于培养基（A：Leu-/Trp-、B: Leu-/Trp- /His-），A平板上的克隆进行计数，根据稀释度计算转库效率（转库效率只有达到 1X107-1X108cfu/gDNA以上才能进行文库的筛选，以保证不会丢失阳性克隆半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验

15、进一步筛选: 从B: Leu-/Trp- /His-平板上挑取 35 个单克隆进行 -半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验，变蓝色的为阳性克隆。参考文献：1、张 蓉 李梅芳 李连喜等. 应用酵母双杂交筛选与 AM172A相互作用蛋白的研究 J . 医学研究杂志中华医学杂志. 2014 . 43(4):37-41.结果：结果： 本研究应用酵母双杂交系统筛选人胎脑 cDNA文库，检测与 FAM172A蛋白相互作用的蛋白，对 10个阳性克隆相应的质粒进行测序后，通过 BLAST在 GenBank数据库中对应 6个不同的基因，编码6种已知的蛋白质： RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和T

16、OX2，根据GenBank数据库及相关文献获得了它们的功能信息。其中 A2M与糖尿病血管病变密切相关，也进一步提示 FAM172A参与了糖尿病大血管病变的发病。（4）阳性杂交克隆的质粒抽提及一对一验证: 对上述筛选的阳性克隆进行质粒抽提，再次进行抗性筛选和质粒抽提后，一对一与诱饵质粒 p GB-FAM172A共转酵母细胞 Y190 验证，再次阳性者抽提质粒进行测序生物信息学分析: 利用 NCBI 对测序所得到的序列进行 BLAST 比对分析。优点优点1、灵敏度高：在真核模式生物酵母中进行的，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。2、高效：转化方法简单，转化效率

17、高，能够比较容易的从cDNA文库或者基因组文库中直接筛选出蛋白质之间相互的蛋白质。3、真实：检测在活细胞内进行，蛋白质经过翻译后的修饰，可能保持其天然空间构想和折叠状态，接近真实生理状态在一定程度上代表细胞内的真实情况。4、简洁：只需构建诱饵表达载体，可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的繁琐步骤。5、广泛：采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。局限性局限性1、它并非对所有蛋白质都适用。 有其原理决定，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。假阳性较多：