高效液相色谱法检测西瓜中四种有机磷农药残留

1、目 录摘 要 .2Abstract .2引言. .31 有机磷农药及其检测方法.31.1 有机磷农药的基本概况.3 1.2 有机磷农药残留的检测方法.5 1.3四种有机磷农药简介.7 2 样品采集与预处理 .92.1 实验仪器和材料.9 2.2 样品的来源与采集.102.3 样品预处理.10 3 四种有机磷农药标准样品的色谱分离.11 3.1 流动相比例、流动相pH和流速的选择.11 3.2 四种有机磷农药标准样品的色谱图.11 3.3 方法学考察.134 西瓜样品中有机磷农药残留的测定与分析 .15 4.1 色谱条件.16 4.2 测试样品.16 4.3 计算四种有机磷农药残留的方法.174

2、.4 两种西瓜样品的检测结果分析.17 5 结论.17 致谢.18参考文献 .18高效液相色谱法检测西瓜中四种有机磷农药残留摘 要 ：本文结合高效液相色谱法对青岛市城阳区大润发中销售的西瓜中有机磷农药残留是否超标进行了检测，并结合有机磷农药的结构特点以及性质建立了一种在高效液相色谱法的基础上能够检测四种有机磷农药残留的方法。 关键词：西瓜；检测；农药Checking out the Four Kinds Of Organic Phosphorus Pesticide Residues In Watermelon By HPLCAbstract ：In this paper，combined w

3、ith HPLC method，researched the watermelon of RT-mart supermarket in Chengyang District of Qingdao City. And it established a method combined with the structure characteristics and properties of organophosphorus pesticide to check out four kinds of pesticides.Key words： Watermelon ;Detection; Pestici

4、de引言 青岛市最近发生了毒西瓜事件，以青岛市胶州市和即墨市为主要城市，共有12个人吃了西瓜后，出现头晕、呕吐等症状，经有关部门鉴定该种西瓜名叫“黑美人”，其中含有农药残留涕灭威，涕灭威是一种有机磷农药。如果食用含有涕灭威超标的食物会使人产生恶心等症状，重者会使人昏迷，甚至死亡。尽管城阳地区还没发生西瓜中有机磷农药超标的事件，但已经引起该地区的人恐慌了，所以研究出一种能够检测西瓜中有机磷农药的现实可行的方法是十分重要的。这是本论文的出发点，所以文对青岛市城阳区大润发所售西瓜中有机磷农药残留进行分析，结合HPLC的原理研究出了能够检测西瓜四种有机磷农药残留的方法。另外，现在基本上没有对青岛市城阳

5、区大润发所售西瓜中有机磷农药残留的研究。所以在有机磷残留方面，本论文对青岛市城阳区大润发所售西瓜的质量评价有很重要的作用。 在我国， 检测和分析食品中的有机磷农药残留的方法一般都采用气相色谱法。当用气相色谱法检测物质的含量时，尽管在灵敏度方面要优于液相色谱法，但是检测部分对热不稳定的农药时，气相色谱法就远远不如液相色谱法容易操作。因为液相色谱法具有对那些热不稳定性物质有较好的检测效果，同时还具有不会浪费过多实验用品和所用时间短的优点。1 有机磷农药及其检测方法 1.1 有机磷农药的基本概况 1.1.1 有机磷农药的定义和分类 有机磷农药是含磷有机化合物，英文简写为OPPs，大多是磷酸酯或酰胺类

6、的化合物，对动物和人体具有危害作用，在自然条件下可以自行分解。 现在在我国所有卖农药的地方，有机磷农药品种有很多，大约占我国所有杀虫剂品种总量的百分之三十七，但产量却高的让人难以想象，大约占农药的百分之七十四。有机磷农药可以用在农业上，例如消灭害虫，保护庄稼，但残留在庄稼上的农药会在食物链中的富集，人们吃了含有农药残留的食物便会中毒，这使得人们的身体健康受到影响。有机磷农药的种类非常多，相对应的性能也就很多了。比如化学性质不稳定、杀虫效率高、易氧化、遇热易分解等等。 1.1.2 有机磷农药的基本性质及其残留危害 有机磷农药纯品的颜色大多是白色，呈晶体状态，有机磷农药在工业上也会有很重要的用途，

7、但与农业上用的稍有不同，一般为黄色油状液体，有跟大蒜或韭菜相似的臭味。密度大多比1要大，溶于有机溶剂,在水中基本上没有溶解性，具有较高的沸点，在自然条件下能保存较长时间，但在碱性条件下比较容易分解。在人和动物体内容易蓄积，从而使人和动物中毒。 农药残留（pesticide residues）指的是农药在被人们使用之后在环境中、生物体和农副产品中残存的降解物农药原体、有毒代谢物、农药原体和杂质的总称。 现在人们大多都使用非持久性的有机磷农药，这种有机磷农药有几周至几个月的降解半衰期。有相关数据说明在某种生态环境下有机磷农药的残留期可以很长时间，残留在在植物体内的有机磷农药被人和动物食用后，会在其

8、体内发生蓄积作用。人们如果在很长一段时期内食用农残超标的食物，不仅会危及到自身的身体健康，而且有的甚至会遗传给影响下一代。 1.2 有机磷农药残留的检测方法 现在，有百分之七十九的农药残留是用气相色谱法(英文简写为GC)来检测和分析的，现在许多国家都会用气相色谱法检测和分析食品中的农药残留。当用气相色谱法检测食品中的有机磷农药残留时，具有不会浪费过多实验用品和所用时间短的优点，上文中还提到尽管在灵敏度和精确度方面要优于液相色谱法，但是检测部分对热不稳定的农药时，气相色谱法就远远不如液相色谱法容易操作，另外这是在有熟悉和掌握有关气相色谱法的实验仪器的人来操作的前提下才能保证其较高的精确度，精密度

9、高的仪器会比较贵，而水果蔬菜的保存期又相对较短，这使得在检测农药残留时，人们一般不会选择气相色谱法，所以说气相色谱法一般在实验室才会用得到。色谱法(Chromatography)是根据分析物质在固定相和流动相之间分配系数的不同而达到分离的目的，由于电信号可以在仪器上显示出来，所以色谱仪是一种采用电信号来代替所测物质的浓度，电信号包括电压和电流等，最后把所测得的电信号接到记录仪上记录下来的分离分析方法。现在，气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法及串联色谱技术是检测有机磷农药残留的主要和首选方法。 高效液相色谱法（HPLC），又称高压液相色谱，它来源于色谱法，与色谱法有着密不可分的联系，高效液相

10、色谱法作的流动相为液体，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入到装有固定相的色谱柱内，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，是一种非常重要的分离分析技术。另外HPLC的色谱柱具有重复使用多次而几乎不影响分离效果的特点，经高效液相色谱分析后的样品比较容易回收，同时对样品的破坏坏程度较小。HPLC的缺点是有“柱外效应”。从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头和检测池等）中，如果流动相流型发生变化，从而导致柱效率降低，所以在用高效液相色谱法分析物质时，一定要尽最大可能保证流动相的流型。 1.3 四种有机磷农药

11、简介 1.3.1 马拉硫磷马拉硫磷又称马拉松，英文名称为malathion ，实验式为C10H19O6PS2，相对分子质量为330.358， 化学名称为O，O-二甲基-S-1，2-二(乙氧基羰基)乙基硫代磷酸酯，是一种高效杀虫剂。马拉硫磷的熔点为2.9-3.7摄氏度，沸点为156-159摄氏度，在15摄氏度时，每升水可以溶解145 mg。在PH值高于7.0时就会失去功效，原因是发生了水解反应，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧所以在运输过程中要注意控制温度。当人体发生马拉硫磷中毒时，会表现出头痛、恶心和多汗等症状，如果误食的话应立即送往医院，首先对病人进行催吐。如不

12、慎进入到眼睛里，用温水冲洗即可。 1.3.2 敌敌畏敌敌畏又称二氯松，英文名称为dichlorvos，实验式为C4H7C12O4P ，相对分子质量为221.98，化学名称为O，O-二甲基-O-(2，2-二氯乙烯基)磷酸酯，是一种广泛的高效杀虫剂。敌敌畏的熔点为-60摄氏度，沸点为74摄氏度，在室温下，每升水可以溶解10g左右，能与大多数有机溶剂混溶。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧所以在运输过程中要注意控制温度。当人体发生敌敌畏中毒时，会表现出头痛、腹泻和流口水等症状，严重者会动作不自主、瞳孔缩小、脉搏和呼吸减慢，甚至停止。人如果误食，应立即

13、送往医院，首先对病人进行催吐，如果不进行救治，可在数十分钟内死亡 。如果皮肤接触到敌敌畏，应最快速用肥皂水反复冲洗。1.3.3 乐果乐果又称乐戈，英文名称为dimethoate实验式为C5H12NO3PS2，相对分子质量为229.12 ，化学名称为O，O-二甲基S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯，是一类光谱杀虫剂。乐果的熔点为52-52.5摄氏度，沸点为86摄氏度，微溶于水，溶于大多数有机溶剂。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧，与强氧接触会发生反应。当人体发生乐果中毒时，会出现中间期肌无力综合症的症状，严重者会呼吸困难，甚至死亡。人如果

14、口服中毒，应立即送往医院，首先对病人用生理盐水反复洗胃 。如果皮肤接触到乐果，尽快用流动着的肥皂水及清水反复冲洗。如不慎入眼，提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗，并及时赶往医院就医。1.3.4 对硫磷对硫磷又称乙基对硫磷，英文名称为Parathion，实验式为C10H14NO5PS， 相对分子质量为291.27，化学名称为O，O-二乙基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯，是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂和杀螨剂。对硫磷的熔点为6.1摄氏度，沸点为157-162摄氏度（在压强为80Pa的条件下），相对密度为1.2656，难溶于水，溶于大多数有机溶剂。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐

15、高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧，与强氧接触会发生反应。当人体发生对硫磷中毒时，会出现呕吐、头痛和全身软弱无力等症状，严重者会呼吸困难，甚至死亡。人如果口服中毒，应立即送往医院，首先对病人用生理盐水反复洗胃 。如果皮肤接触到对硫磷，尽快用流动着的肥皂水及清水反复冲。2 样品采集及预处理 2.1 实验仪器与材料 2.1.1 实验仪器 配有紫外检测器的HPLC(1100型)，孔径为1504.6mmi.d 的色谱柱（Zorbax elipse XDB C18），滤膜的厚度为0.45微米，高速组织捣碎机，氮吹浓缩仪，旋转蒸发仪。 2.1.2 实验材料和试剂 甲醇，超纯水，二氯甲烷，无水硫酸钠、氯化钠

16、；马拉硫磷标准样品、敌敌畏标准样品、对硫磷标准样品、乐果标准样品。采用每毫升100微克作为四种有机磷农药的标准浓度。 配制有机磷农药标准实验液步骤： 先用微量进样器量取1mL四种有机磷农药的标准品，然后用甲醇分别定容为每毫升10微克的标准储备液，并放在冰箱里保存备用。(1)从冰箱里取出储备液，用微量进样器量取每毫升10微克的标准储备液1毫升于100毫升容量瓶中，然后用甲醇定容为每毫升0.1微克的混合标准实验液备用； (2) 用微量进样器量取每毫升10微克的混合标准储备液1毫升于20毫升容量瓶中，用甲醇定容为每毫升0.5微克的标准实验液备用； (3) 用微量进样器量取每毫升10微克标准实验液1毫

17、升于10毫升容量瓶中，然后用甲醇定容为每毫升1.0微克的标准实验液备用；(4) 用微量进样器量取每毫升10微克的标准实验液1毫升于10毫升容量瓶中，然后用微量进样器量取1毫升甲醇加到容量瓶中定容为每毫升5.0微克的标准实验液备用；(5) 用微量进样器量取标准储备液1毫升制成每毫升10.0微克的标准实验液备用。 2.2 样品的来源与采集 2.2.1 样品来源 样品取自青岛市城阳区大润发中销售的京欣西瓜和浙江平湖西瓜 。 2.2.2 样品的采集从青岛市城阳区大润发中挑选个头大、品质好的两种西瓜样品各五个，带回实验室。2.3 样品的预处理用清水对采集的两种西瓜样品进行清洗，然后用去离子水清洗，用纱布

18、轻轻擦干。取一个京欣西瓜样本其中可以食用的部分用高速组织捣碎机捣碎混匀。 取1升匀浆于分液漏斗中进行萃取，剩下的匀浆放入-20摄氏度冰箱长期保存备用，将溶液的PH值调节为中性，加入约40克氯化钠，待氯化钠完全溶解，然后加入二氯甲烷50 毫升于水样中，振荡萃取5 分钟，静置分层后，收集有机相，共萃取 3 次，合并3次萃取液，用无水硫酸钠干燥。将干燥后的萃取液转移到旋转蒸发仪中浓缩至 5毫升，然后在氮吹浓缩仪上继续浓缩至1毫升。浙江平湖西瓜样本的处理过程如京欣西瓜。 3 四种有机磷农药标准样品的色谱分离 3.1 流动相比例、流动相pH和流速的选择实验选择甲醇:水= 68.5:31.5（体积比），选

19、择中性或微酸性条件下来对流动相pH进行选择，选择 pH 为 6 作为流动相的最优pH;一般的实验流速分为每分钟0.6毫升， 每分钟0.8毫升和每分钟1.0毫升，流速对本实验结果影响可以忽略不计，所以用每分钟1.0毫升的流速来进行试验，在此条件下可以对四种农药残留分离和分析。 3.2 四种有机磷农药标准样品的色谱图 在色谱条件下：紫外检测器，流速为每分钟1毫升，流动相pH为6，甲醇:水 = 68.5:31.5（体积比）， 进样量均为20L， 对不同的浓度下四种有机磷农药标准样品做色谱图。图3.2-11 乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷图3.2-21 乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4

20、对硫磷图3.2-31 乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷图3.2-41 乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷图3.2-51 乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷3.3 方法学考察 3.3.1 工作曲线 从上图的分析结果中可以得出，四种标准有机磷农药的的峰面积与质量浓度的有很好的线性关系，可以满足定量分析的要求。由高效液相色谱仪得出的色谱图，可以观察到四种农药的峰面积，做出峰面积与有机磷农药在不同浓度下时的线性回归，如下图根据美国EPA，方法检出限为 MDL=St(n，1-a)，若对本实验做七次重复试验，置信水平就会达到百分之99，查t 值为3. 14。T表示自由度为n-1时

21、的Students t 值；1-a表示置信水平；S表示n次加标测定浓度的标准偏差；N表示重复测定的加标样品数。 四种农药的线性回归方程、相关系数、最低检出限如下表所示。表3.3.1-1 四种有机磷农药组分的线性关系和最低检出限有机磷农药线性方程相关系数最低检出限(g/L) 对硫磷 y = 82.90x + 45.780.9991.0马拉硫磷 y = 117.48x + 88.40 0.9931.5乐果y = 208.89x + 445.68 0.9991.1敌敌畏y = 177.79x + 678.81 0.9991.13.3.2 计算西瓜样品回收率和精密度 精密度用以表示测量方法的重现性，一

22、般测定 5到10 次，用来说明所测的数据之间相互的接近程度。相对标准偏差（RSD）指的是：标准偏差与计算结果算术平均值的比值，即：相对标准偏差（RSD）=标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）100%。分析测试结果的精密度一般用相对标准偏差来表示。用微量进样器量取浓度为每毫升9微克的超纯水1毫升，加入浓度为每毫升10微克的标准浓度混合液中，按照3.2的实验方法来分析，进行7次重复试验后得下表。 表3.3.2-1 样品回收率（n=7）有机磷农药加标量/g/m L平均测定量/g/m L平均回收率/%对硫磷1.00.9191马拉硫磷1.00.8383敌敌畏1.00.9596乐果1.00.929

23、2表3.3.2-2 四种有机磷农药的相对标准偏差(RSD) （n=7）有机磷农药标准偏差（SD）算术平均值相对标准偏差（RSD）对硫磷0.0490.915.4%马拉硫磷0.0470.835.7%敌敌畏0.0340.953.6%乐果0.0350.923.8%通过上表可以得知：样品的平均回收率在百分之八十三至百分之九十五之间，说明用高效液相色谱法对样品进行试验的回收率较高；相对标准偏差在百分之三点六至百分之五点七之间,说明用高效液相色谱法对样品进行试验的精密度也很高。 4西瓜样品中有机磷农药残留的测定与分析 4.1 色谱条件 检测器使用紫外检测器； 流动相为甲醇和超纯水，使用甲醇：超纯水=67:3

24、3作为体积比；流速为每分钟1毫升，进样的体积为20L；流动相的pH 为7。 4.2 测试样品 对青岛市城阳区大润发所售西瓜进行有机磷农药残留的检测与分析，检测结果如下图。京欣西瓜液相色谱图图4.2-2浙江平湖西瓜液相色谱图4.3 计算四种有机磷农药残留的方法 测定西瓜样品中有机磷农药残留的浓度，用 c2/c1 =a2/a1进行计算：a1表示标准样品的色谱图上的峰面积；a2表示被测定样品的色谱图上的峰面积；c1表示标准样品中有机磷农药浓度，单位为g/m L； c2表示被测定样品中有机磷农药浓度，单位为g/m L。4.4 两种西瓜样品的检测结果分析 两种西瓜样品检测结果汇总如下 样品有机磷农药浓度

25、（ug/L）乐果敌敌畏马拉硫磷对硫磷京欣西瓜34.222.500浙江平湖西瓜24.838.200国家标准关于蔬菜和水果农药残留最高限量规定中乐果1.00mgkg、敌敌畏0.20mgkg、对硫磷0.00 mgkg、马拉硫磷0.00 mgkg。所以两种西瓜四种有机磷农药残留都符合国家标准。 5 结论 使用高效液相色谱法同时检测西瓜中四种有机磷农药的方法是本研究首次采用的。四种有机磷农药可以同时被HPLC分离和制备，pH 为7时的流动相、每分钟流动相的进入量为1.0毫升以及20微升作为进样量时，高效液相色谱法能够分离对硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、乐果这四种有机磷农药。在该条件下，每升1.5微克、每升1.

26、1微克、 每升1.0微克、每升1.1微克分别为马拉硫磷、乐果、对硫磷、敌敌畏的最小检出限；回收率在百分之八十四至百分之九十五之间，相对标准偏差为百分之三点七至百分之五点六3.，具有较高的精密度。 另外，HPLC测定西瓜中的有机磷农药残留，主要有以下四点优点： (1)相对于流动相来说，以甲醇与水的比为67:33（体积比）为流动相，比用甲醇与水的比为7030（体积比）做流动相，有很乐观的分离效果，并且在操作上也更容易。 (2)相对于流动相的 pH 来说，在pH 为6时的流动相下，有机磷农药中的的对硫磷、马拉硫磷、敌敌畏、乐果这四种成分能够分离出来，出来的峰的对称性和峰的个数具有良好的效果。 (3)

27、对于精密度来说，此次实验中，四种有机磷农药残留的相对标准偏差在百分之三点七至百分之五点六之间，所以在精密度上也很高。(4)相对于检出限来说， 乐果和对硫磷的检出限每升1.0微克和每升1.1微克分别为对硫磷和乐果的检出限，检出限降低之后，检测的灵敏度自然就会得到提高。 经过上述实验，说明在检测西瓜中敌敌畏、对硫磷、乐果和马拉硫磷这四种有机磷农药残留时，此种方具有比较乐观的法分离效果，通过四种农药残留的检出限来看，该方法也具有较高的灵敏度。致谢 现在，本论文基本完成，首先我要深深地感谢我的导师孙萍老师！为了我能顺利完成此篇论文，孙老师花费了很多宝贵的时间，给予了我颇多的耐心，精心指导我完成了本篇论

28、文。在此，我十分感谢孙老师对我的关怀和帮助，感谢导师两年来对我的培育之恩。本文的研究，大多数工作是在海润农大第三方检测机构和青岛农业大学图书馆完成的，期间多亏了孙萍等老师和好友陈浩东同学、马圣听同学的无私的付出和悉心关怀，我对他们表示深深地感谢。另外，我的父母在我大学期间给于我无私的关怀与照料，无微不至的支持和帮助，这样才使我的学业能够顺利完成。还要感谢在本论文评议、评阅过程中提出宝贵建议的老师、专家，在此献上我真诚的敬意。 参考文献：1杨克钦.俞宏.刘彦.何为华.张劲强.李君 国内外西瓜甜瓜农药残留最高限量及其检测技术期刊论文-中国西瓜甜瓜2002(2)2 林逢春 农药污染与生态环境 200

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