醇诱导下番茄果实的时防御反应

1、西南科技大学本科生毕业论文 southwest university of science and technology本科毕业设计（论文）醇诱导下番茄果实的防御反应 学院名称生命科学与工程学院专业名称生物技术学生姓名学号指导教师醇诱导下番茄果实的防御反应摘要：本文以香叶醇和叶醇诱导的番茄果实为材料，通过测定果实多酚氧化酶活性和防御相关基因的表达，研究了醇诱导下番茄果实的防御反应。结果表明，香叶醇和叶醇诱导能够引起植物的防御性反应。与香叶醇相比，叶醇处理对果实的伤害作用更为明显，引发了更多的多酚氧化酶活性的提高。随着香叶醇或叶醇处理的时间延长，经过醇诱导果实中的cdi、ps及inhii基因的表

2、达量越高; 而lox基因属于早期基因，随着香叶醇或叶醇处理的时间延长， lox基因的表达量越低。关键词：多酚氧化酶；防御反应；信号途径；醇诱导defense-related response induced by alcohol application in tomato fruitabstract: in this paper, polyphenol oxidase (ppo) activity and the expression of defense-related genes including cdi, ps, lox and inhii were detected in tomat

3、o fruits that were treated with exogenous geraniol and 3- hexenol. the results showed that geraniol and 3- hexenol could trigger the defensive response in tomato fruits. compared with geraniol, 3- hexenol treatment had obvious wounding effect on fruit, triggering more increased activities of polyphe

4、nol oxidase. with time extending of geraniol or 3- hexenol treatment, the expression of cdi, ps, and inhii gene induced by alcohol was higher, but since the lox gene belongs to early expression gene, the expression of lox induced by the alcohol was lower with geraniol or 3- hexenol treatment time pr

5、olonging.keywords: polyphenol oxidase; defense response; signal pathway; alcohol application目录醇诱导下番茄果实的防御反应- 2 -摘要- 2 -关键词- 2 -alcohol induced defense responses in tomato fruit- 3 -abstract- 3 -keywords- 3 -第1章绪论- 6 -1.1植物诱导防御反应相关的主要信号转导途径- 6 -1.1.1茉莉酸 (jasmonieaeid，ja)信号途径- 6 -1.1.2水杨酸(salicylic ac

6、id，sa)信号途径- 9 -1.1.2.1水杨酸信号途径在抗虫防御中的作用- 9 -1.1.2.2水杨酸信号途径在抗病防御中的作用- 9 -1.1.3乙烯(ethy-ene，et)信号途径- 10 -1.1.3.1乙烯的合成- 10 -1.1.3.2乙烯信号途径在植物抗病虫防御反应中的作用- 11 -1.1.4过氧化氢 (hydrogenperoxide，hzoz)信号途径- 12 -1.1.5植物防御反应中几种信号途径的相互作用- 13 -1.2防御相关基因的表达- 14 -1.2.1诱导抗虫基因- 14 -1.2.2防御蛋白基因- 16 -1.2.3防御物质合成基因- 17 -1.2.4

7、信号途径基因- 18 -第2章材料与方法- 20 -2.1实验材料与仪器- 20 -2.1.1植物材料- 20 -2.1.2pcr引物序列- 20 -2.1.3生化及分子生物学试剂- 20 -2.1.4仪器和设备- 20 -2.2实验方法- 21 -2.2.1ppo多酚氧化酶的比活性测定- 21 -2.2.2防御相关基因的诱导表达情况- 22 -2.2.2.1rna专用试剂和耗材的处理- 22 -2.2.2.2果实rna的提取- 22 -2.2.2.3荧光定量pcr分析- 23 -第3章结果与分析- 25 -3.1香叶醇和叶醇的诱导对番茄果实多酚氧化酶活性影响- 25 -3.2醇处理对防御相关

8、基因lox, cdi, ps, inhii表达的影响- 27 -3.2.1荧光定量pcr扩增效率、相关系数和溶解曲线- 27 -3.2.2醇诱导对lox基因表达的影响- 27 -3.2.3醇诱导对cdi基因表达的影响- 28 -3.2.4醇诱导对ps基因表达的影响- 29 -3.2.5醇诱导对inhii基因表达的影响- 30 -第4章结论- 32 -致谢- 33 -参考文献：- 34 -第1章 绪论植物是通过根系而固定在地面上的有机体,它主要依靠根系从土壤中得到养分和水分,因而其缺乏可能的逃避机制以防止昆虫捕食引起的损伤、各种物理损伤、各种病原菌侵染引发的损伤。在长期的协同进化过程中，植物为了

9、更好的适应环境，逐渐的形成了一套与其相适应的防御植食性昆虫的策略。这些防御措施可以分为组成型和诱导型两种。组成型的防御反应是指植株在受到害虫攻击前就已经存在的物理和化学的防御特征。物理性的防御特征有很多，例如角质层、硬化或木质化的覆盖物、毛状体以及刺和其他的一些特化了的器官;化学防御则主要包括一些次生化合物，如尼古丁。诱导型的防御反应是指植株在受到害虫危害时而表现出来的一种防御性反应，这可以分为直接诱导防御反应和间接诱导防御反应1 。直接诱导防御反应指的是植物通过增加次生代谢产物，如酚类化合物、菇类化合物、蛋白酶抑制剂、等影响植食性昆虫的生长、发育与繁殖。植物在遭受到植食性昆虫危害时，还可以释

10、放出一些特殊的挥发性物质或者分泌些花外蜜露来引诱天敌或为天敌提供食物，从而达到通过天敌作用来保护自己，这就是植物的间接诱导防御反应。1.1植物诱导防御反应相关的主要信号转导途径植物的防御反应是由一系列的信号分子和转录调节子所调节的一个复杂的网络。至今，已经有了很多的研究表明植物体内的水杨酸、茉莉酸、过氧化氢以及乙烯等信号分子在植物的虫害诱导防御反应中起到了重要的作用。这四个重要的信号分子既可以去调节特异的防御反应同时也可以调节普遍的防御反应。不同信号分子之间的相互作用也使得防御相关基因的有序表达。1.1.1茉莉酸 (jasmonieaeid，ja)信号途径ja 是伤害反应的信号分子。其挥发性衍

11、生物茉莉酸甲酯是蛋白酶抑制子的一种诱导物(farmer和 ryan 1990)。茉莉酸在植物防御中的作用主要是通过分析拟南芥防御信号传导途径突变体来加以验证的，这些突变体不能正常合成或感知 ja，与野生型植株相比，更易感染病原菌2。在虫害的条件下，植物体内ja及其衍生物的含量显著的增加，这些物质激活了植物体内相应的防御基因(表1.1)，使植物体产生了各种类型的化学防御物质。应用外源ja和meja能够诱导植物产生对害虫有毒、抗营养和抗消化作用的化合物，对害虫生理活动产生不利的影响;也能够产生对害虫有驱避和妨碍其行为的化合物，从而干扰昆虫的行为。如应用外源ja和meja处理烟草。可诱导烟草从头合成

12、烟碱，使得整株烟草的烟碱含量提高2一10倍，从而产生抗虫性。外源ja和meja也可以诱导植物产生多酚氧化酶、pl等，从而会抑制昆虫的生长发育。外源ja和meja诱导植物产生的挥发性有机化合物可以引诱寄生性天敌或驱避植食性昆虫。如kessler和baldwin应用外源meja处理烟草后，会释放出大量的有机化合物，这些化合物对番茄天蛾成虫产卵有极大的驱避作用。 thaler(1999)在田间应用ja处理番茄，诱导其产生的挥发性有机化合物能够吸引主要害虫甜菜夜蛾的主要的寄生蜂甜菜夜蛾镶颗姬蜂。另外，ja在植物的抗病反应中也发挥了重要的作用。如在植物的过敏性反应中，ja合成途径中的一些基因如脂氧合酶等

13、表达的水平明显上调。ja可以诱导植物抗病基因的表达或者激活植物的防御基因，例如一些蛋白酶抑制剂、编码防卫素等，从而使植物产生了抗病性。1.1.2水杨酸(salicylic acid，sa)信号途径1.1.2.1 水杨酸信号途径在抗虫防御中的作用sa是一种植物体内普遍存在的与防御反应相关的信号分子。现有的研究结果表明，sa在诱导的植物直接抗虫反应中发挥了重要的作用。例如sa处理能够提高柳树的抗性3，降低了虫的成活率。sa在虫害诱导间接防御中也发挥了一定的作用。王霞(2007)的研究表明，褐飞虱为害能够迅速导致水稻体内sa含量的上升；同时，外用sa能够诱导水稻释放出引诱稻虱缨小蜂的挥发物。说明褐飞

14、虱为害激活的sa信号转导途径在水稻挥发物的合成过程中起到重要的作用。1.1.2.2 水杨酸信号途径在抗病防御中的作用sa信号转导途径在植物抗病中的作用已经有了很多的研究。病原物侵入植物后，被侵染部位的局部组织、细胞迅速死亡，产生了枯斑，并连同病原生物同归于尽，从而阻止病原生物的侵染进一步的扩大。这种保护性坏死被称为过敏性反应 (hypersensitiveresponse，hr) 4。如马铃署晚疫病菌的菌丝与植物细胞质膜接触10到60分钟后，寄主细胞就会坏死。hr发生后，还会诱导整株植物对同一种病原或其他病原产生抗性，即形成了系统获得性抗性 (systemicacquiredresistanc

15、e，sar)。sa是植物产生hr和sar所必需的。目前把sa作为诱发sar的信号分子主要依据可以概括为:外源sa可诱导多种植物表达病原相关蛋白，合成植保素，诱导产生活性氧，并产生对真菌、细菌、病毒等多种病原菌的抗性；在sar基因表达及sar产生之前，内源sa先积累，并且sa积累的水平与抗性的强弱呈现正相关；sa适于在植物韧皮部中进行长距离的输送；水杨酸轻化酶基因的转基因烟草和拟南芥试验的结果表明，sa是植物产生的sar所必需的，许多诱抗因子诱导植物产生sar需要通过积累sa的途径。水杨酸在植物体内的信号调节作用到目前为止至少有两种机制，一种需要npr1(nonexpressor of path

16、ogenesis- related genes l)基因的参与，第二种不需要npr1基因的参与。1.1.1 乙烯(ethy-ene，et)信号途径1.1.3.1 乙烯的合成几乎所有的植物组织都能够产生et，但是在大多数情况下浓度都会很低。yallg和 hoffinan(1984)通过一系列精巧的实验阐明了et的合成途径5。et衍生自甲硫氨酸(图1.2)，它的产生过程可以分为以下三个步骤:(1)iti硫氨酸在s-腺昔甲硫氨酸合成酶(s- adometsynthetase，sams)催化下变成s一腺昔甲硫氨酸(sam)(图1)。sam是植物体内主要的甲基供体，用做许多生化合成途径的底物，例如et合

17、成途径和精胺/亚精胺合成途径等。(2)am在acc合酶 (accsynthase，acs)的催化下产生了氨基环丙烷梭酸(l-aminoeyelo-propane小earbo翔 lieaeid，acc)和5-甲硫腺昔 (methylthioadenosinemta)。acc合酶是整个et合成途径中的关键酶和限速酶。acc用于产生et;mta则会通过甲硫氨酸循环后变回甲硫氨酸。(3)acc在acc氧化酶 (accoxidase，aco)的催化下产生了et。1.1.3.2 乙烯信号途径在植物抗病虫防御反应中的作用关于et信号途径的了解大部分都来源于遗传学的研究。通过对分离得到的拟南芥突变体进行遗传学

18、及分子生物学的研究分析，已经在拟南芥中确立了一条从细胞膜上对et的识别到细胞核内转录调控的et信号转导途径。et信号转导途径在害虫防御中发挥着很大的作用。et信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中是必需的。鲁玉杰等以水稻褐飞虱及其卵期寄生蜂稻虱缨小蜂6为研究对象，通过分析褐飞虱为害后水稻et释放量的变化以及et、水稻挥发物和对寄生蜂引诱作用三者间的关系，研究了et信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中的作用。结果表明，在受褐飞虱为害后2-24h，受害稻株释放的et浓度一直显著地高于未处理稻株;利用乙烯利在酸性水溶液中释放的et处理水稻后，水稻能释放与褐飞虱为害株相类似的挥发物组

19、成相，并且两者表现出对寄生蜂相同的引诱活性;在褐飞虱为害之前利用et受体的抑制剂1-甲基环丙稀处理水稻，可明显抑制褐飞虱诱导的大部分水稻挥发物组分，并且对稻虱缨小蜂的引诱作用也受到抑制。et信号途径在抵抗病原菌的侵入方面也起着很大的作用。裴雁曦(2003)通过微阵列杂交对所检测到的信号转导相关基因及部分抗病相关基因间相互作用进行了分析，研究表明，受白叶枯菌侵染后，et介导的信号转导途径可能起重要作用(图1.3)。注:z轴、y轴分别为95、14r受诱导后表达丰度标准值的常用对数值;黑点为检测到的有效数据;三角形为检测到的部分与信号传导或抗病相关的基因;标注框内数字为14r与95表达丰度的比值。就

20、植物对某些病原的抗性来讲，et信号转导途径是必要的，对于系统获得性抗性的获得也是极其重要的。1.1.2 过氧化氢 (hydrogenperoxide，hzoz)信号途径植物在遇到各种环境侵害，如低温、高温、高盐、干早、高渗透压及病原感染等，植物自身会发生应激保护措施。植物在应激反应中会产生大量的活性氧 (activeoxygenspecies，aos)，活性氧是指那些含有氧原子的但具有更活泼的化学反应性的氧的某些代谢产物及其衍生物7，主要包括超氧阴离子，过氧化氢(h202)及轻自由基(oh.)3种，其中hz仇是一种相对稳定的氧化物。多种植物病害系统中都有hzoz的积累，h202在植物抗病反应中

21、的作用受到广泛的重视。如apostof等用真菌细胞壁制备的寡聚半乳糖醛酸激发子可诱导大豆悬浮培养细胞产h202。legendre等用柑桔果胶制备的寡聚半乳糖醛酸也能诱导大豆悬浮培养细胞产生h202。来自病原真菌及植物的葡聚糖、半乳糖醛、寡聚肤等诱发物处理均可诱导植物产生h202。目前，在植物与病原菌互作过程中h202的机制还不是很清楚，但综合前人所做的工作，可以发现hzoz在植物抗病反应中所起的作用是多方面的:(1)直接抑制和毒害病原菌;(2)引起寄主膜脂过氧化，导致过敏性反应;(3)促进寄主细胞壁的木质化和细胞壁结构蛋白的交联使得细胞壁的结构得以增强是病原菌侵染后植物产生的主要防御反应之一;

22、(4)诱导植保素的合成(饶力群等，2000)。它在虫害诱导防御中也发挥着重要的作用。如在玉米中过量表达大麦的脚基因会引起玉米中hzoz含量明显上升，并最后导致对欧洲玉米螟的抗性增加 8。在烟草 nicotianaattenuata的研究中也发现，glp基因与烟草体内hzoz的产生有关;当反义抑制脚基因在烟草中的转录水平时，会导致烟草h202及次生化合物含量下降，最后导致抗虫性降低(lou&baldwin，2006)。王霞等(2007)的研究证明，褐飞虱为害迅速导致水稻体内h202的含量上升(图 1.4)，同时，外源高浓度的hzoz能诱导水稻释放对稻虱缨小蜂具有明显引诱作用的挥发物。说明h202

23、信号转导途径可能在水稻挥发物的合成中起作用。1.1.3 植物防御反应中几种信号途径的相互作用水杨酸和茉莉酸是植物防御反应中的信号物质。水杨酸主要在植物对病原菌的过敏反应和系统获得抗性中发挥作用,它还可能参与刺吸式害虫(如蚜虫、二斑叶螨等)取食诱导的植物间接防御反应。乙烯与茉莉酸主要是在机械损伤、虫害诱导和真菌性病原菌的直接和间接防御反应中起到作用。水杨酸、茉莉酸和乙烯,各个信号途径之间也可以相互影响9。例如,水杨酸和它的作用类似物2, 6-二氯异烟酸和苯并噻二唑可抑制依赖茉莉酸的防御基因的表达,其原因可能是ina、水杨酸或bth抑制了茉莉酸的合成和茉莉酸的作用。同样,受烟草花叶病毒(tmv)侵

24、染的烟草表达系统获得抗性基因后,并不能够产生正常植株的茉莉酸介导的伤口反应,原因可能是tmv侵染后水杨酸得水平增加,抑制了茉莉酸信号途径。因此,用高度得表达水杨酸的方法去增加植物对广谱性病原菌抗性的途径,可能会使植物对昆虫或另外一些病原真菌的抗性降低。很多报道都认为茉莉酸和乙烯具有协同作用,它们能够协同激活编码防御蛋白(如蛋白酶抑制剂)的基因。在某些情况下,茉莉酸和乙烯能够促进水杨酸的作用导致相关蛋白基因的表达。沉默苯丙氨酸解氨酶基因,获得低水平水杨酸的转基因烟草,对tmv表现出较低的系统获得抗性而对烟芽夜蛾幼虫抗性增加,高度表达苯丙氨酸解氨酶基因10的烟草对tmv的系统获得抗性增加而对美洲烟

25、夜蛾幼虫的抗性下降。利用系统获得抗性诱导物bth处理,番茄对甜菜夜蛾的抗性降低,原因可能是bth抑制茉莉酸的合成或增加水杨酸的合成。茉莉酸处理野生型拟南芥能增加其对埃及棉叶虫的抗性。缺乏茉莉酸反应途径的突变体对埃及棉叶虫敏感,缺乏系统获得抗性的突变体npr1对埃及棉叶虫具有较高的抗性。在烟草与烟草天蛾系统中存在一些特殊的情况。当烟草被耐烟碱的烟草天蛾取食后,茉莉酸水平增加,一般同机械伤害的程度成正比,随后形成茉莉酸高峰,产生210倍的伤害水平引起的茉莉酸量,在昆虫继续取食前迅速传导到叶片前端。伤口和茉莉酸诱导的反应不产生乙烯,但烟草天蛾取食能诱导乙烯大量产生,并在幼虫取食过程中一直存在。乙烯抑

26、制了伤口和茉莉酸诱导的烟碱合成、napmt1基因表达等植物的直接防御反应,但不抑制释放voc的间接防御反应,因而能够吸引寄生性天敌,但这种间接防御不能被伤口诱导。总之,烟草天蛾取食会导致烟草对害虫的直接防御(烟碱合成)反向调控,而对间接防御进行正向调控,释放吸引天敌的化合物11。由于烟碱能被烟草天蛾所代谢并作为烟草天蛾对寄生蜂的防御物质,因此烟草可能调整自身的变化增加间接防御以对抗烟草天蛾的取食。1.1 防御相关基因的表达自从 green and ryan (1972)报道了植食者取食后植物随后发生的化学变化提高对昆虫攻击的抵抗能力，人们广泛认识到植物的化学组成不仅受非生物因子影响，而且也在相

27、当程度上受机械损伤或植食者取食的影响。显然，即使不是所有的植物，但至少许多植物除结构性防御系统外，还存在诱导防御系统。然而，人们原先只注意到植食者取食后植物的化学成分，如糖、蛋白质、防御性酶和次生物质等含量的变化。随着分子生物学理论和技术的发展，研究者开始从分子水平研究植物的诱导抗性。该领域的研究为了解植物和植食者之间的相互适应和协同进化，也为害虫治理提供新的思路和手段。国内对植物诱导抗虫基因的克隆和调控方面的研究还很少，本文介绍国外对植物防御害虫的诱导抗性基因种类和调控两方面的研究，其对国内开展这方面的研究有所推动。1.2.1 诱导抗虫基因害虫对植物的损伤极大改变了植物的新陈代谢。arimu

28、raetal发现棉红蜘蛛(tetranicusurticae)危害提高了利马豆(phaseolus lunatus )97 个基因的表达量，而棉红蜘蛛诱导利马豆释放的挥发性物质提高了利马豆 227 个基因的表达量。在研究拟南芥(arabidopsis thaliana)叶片在机械损伤、水分胁迫和菜青虫取食后 150 种基因表达的时机、动态和调控后，发现有一种基因的表达只受昆虫取食诱导(reymond et al., 2000)。hermsmeier et al. (2001)用mrna 差异显示法提供了烟草在烟草天蛾(mandu-ca sexta)攻击下的转录特征，获得了差异显示的 27个 c

29、dna，并分析得害虫攻击负向调控参与光合作用的转录产物，而正向调控将碳氮转变为防御物质的防御性转录产物。将 mrna 差异显示的反转录pcr 和磁珠减法杂交结合进一步研究受烟草天蛾攻击下烟草防御反应，克隆了 112 个转录产物12。zhu-salzma et al. (2004) 研究了蚜虫（schizaphis graminum) 攻击对高粱(sorghum bicolor)mrna 积累的改变，用 cdna 差异性减去法获得672 cdna，并从中确定出对蚜虫取食、茉莉酮酸酯（ 甲基茉莉酮酸酯）或水杨酸施用有反应的 82 个转录产物，对损伤后的植物基因表达的研究表明，与防御相关的基因的表达

30、增强，而与生长发育相关的基因受到负向调控。由此可见，植物在害虫为害后大量的基因表达受到改变，其中部分基因的诱导表达起到抗虫的作用。ryan将植物受损伤后新合成蛋白的解码基因可分为 3 类：抗营养蛋白或防御基因、信号途径基因和蛋白酶基因。gatehouse进一步将受到正向调控的基因分为 3 类：防御基因包括防御蛋白如蛋白酶抑制剂基因和次生物质合成酶基因；信号途径基因包括那些作为信号的挥发性物质合成相关的基因；改变代谢路径而合成防御物质的基因，如参与蛋白转变的蛋白酶。在此基础上，本文根据基因在植物防御害虫中的作用将诱导表达的基因分为 3类：基因产物蛋白直接对昆虫有毒害作用的防御蛋白基因，如蛋白酶抑

31、制剂基因；基因蛋白本身对昆虫没有直接的毒害作用，但基因蛋白的直接或间接产物对昆虫有直接或间接防御作用的防御物质合成基因，包括次生物质合成酶基因和其代谢途径基因；基因的直接或间接产物起到防御信号的传播和扩大作用的信号途径基因，如作为信号的挥发性物质合成相关的基因13。由于有些信号基因的产物除了起到信号传播作用外还直接对昆虫有防御功能，这时信号途径基因和防御物质合成基因并不能截然分开1.2.2 防御蛋白基因1.2.2.1 蛋白酶抑制剂（ proteinase inhibitor, pin）基因pin 是小分子蛋白质，对昆虫有防御作用。pin 抑制昆虫消化性蛋白酶，导致昆虫由于饥饿而生长迟缓和死亡。

32、植物受植食性昆虫或机械损伤后诱导pin mrna 的 积 累 (green and ryan,1972; ryan,1981)，且这种积累是局部和系统性的(cordero et al.,1994)。昆虫损伤还诱导玉米、马铃薯、水稻和西红柿的 pin 基因的表达(anderson et al., 1997)。受损伤诱导的 pin 基因主要有半胱氨酸蛋白酶抑制剂cpin、丝氨酸蛋白酶抑制剂 spin 和胰岛素蛋白酶抑制剂 tpin 基因。1.2.2.2 半胱氨酸蛋白酶抑制剂（ cysteine proteinaseinhibitor, cpin）基因 cpin 基因广泛分布于植物中，并已从许多植物

33、中分离出，包括水稻(abe et al.,1987)，豇豆(fernandes et al., 1993)和玉米(abe et al.,1992)等。这些蛋白质都参与植物防御害虫，特别是防御鞘翅目和半翅目昆虫14。伤口诱导的信号传输途径激活了 cpin 对害虫和病原菌攻击的反应。如损伤局部和系统地诱导大豆上的 cpin cdna 克隆 r1 和 n2 的转录产物，同时也提高木瓜蛋白酶的活性，这意味着 r1 和 n2 在植物防御中起作用。1.2.2.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂（ serine proteinase in-hibitor, spin）基因 spin 特异性地抑制丝氨酸蛋白酶，而且有直接

34、证据表明它们在寄主植物中防御植食性昆虫的作用。spin 的积累可局部发生于受害部位和系统地发生于远离受害部位的其它器官。至少在茄科植物，spin mrna 局部和系统性的积累是植物防御反应的一个组成部分，这种反应是由害虫或病原菌攻击发起并由最终调控解码这些蛋白质的基因转录的信号传导所决定的。1.2.2.4 胰岛素蛋白酶抑制剂（ trypsin proteinase in-hibitor, tpin）基因 紫花苜蓿上，tpin 基因在叶片的表达受损伤诱导。白杨上一类与 tpin 类似的mrna 也是损伤诱导的(hollick and gordon , 1993)。1.2.2.5 黑芥子酶结合蛋白

35、（ myrosinase-binding pro-teins, mbp）基因 存在于油菜种子中的 mbp 族的蛋白具有外源凝集素活性，非常高效地结合氨基苯基 -d- 甘露糖吡喃糖苷 - 琼脂糖和一定程度地结合 n- 乙酰基葡萄糖胺 - 琼脂糖。损伤后 mbp 的转录产物积累于新老叶片上，并且在幼龄植株上系统地表达(taipalensuu et al., 1997)。机械损伤和小菜蛾取食都能诱导油菜上 mbp 的转录表达(pontoppidanet al., 2005)。1.2.3 防御物质合成基因1.2.3.1 氧化酶基因氧化酶中的过氧化物酶和多酚氧化酶都能把植物组织中的成分氧化成毒性物质(r

36、oyo et al., 1996)，所以它们参与植物防御害虫的反应(felton et al., 1992; dowd and lagrimi, 1997)。1.2.3.2 过氧化物酶基因过氧化物酶基因表达受损伤的诱导。阴离子过氧化物酶在大豆叶片上的mrna 积累是由机械损伤造成的 (diehn et al.,1993)。烟草过氧化物酶基因的表达受损伤诱导，先局部后系统地表达(hiraga et al., 2000)。参与乙烯生物合成途径的 ac（c 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸）氧化酶基因在桃叶片上受损伤诱导表达 15。1.2.3.3 多酚氧化酶基因多酚氧化酶明显降低昆虫饲料中的蛋白质的含

37、量，从而减少取食这种饲料的幼虫的生长(felton et al., 1992)。由于多酚氧化酶的表达是由损伤诱导的，所以它很可能参与防御反应(constable et al., 1995)。然而缺乏这种酶对昆虫毒性的直接证据，已经进行的转基因植物实验中，过氧化物酶的大量表达对植物没有明显的保护作用。1.2.3.4 细胞色素 p450 单氧酶基因细胞色素 p450单氧酶是依赖亚铁血红素的多功能氧化酶系统，利用 nadph 和 / 或 nadh 还原裂解二氧化合物成功能性有机物和一分子水。p450 调节植物次生代谢合成中的许多氧化反应，包括苯基异丙酮和植物抗毒素。另外一些自然代谢产物包括植物苯基异

38、丙酮、类萜、生物碱、脂肪酸和 ga 前体都是 p450 调控的反应生物合成的。植物 p450 参与这么多的防御物质的合成意味着植物中的 p450 比哺乳动物更加多样(durst et al., 1994)。但对不同 p450 同工酶在植物中的数量和它们的表达模式还不清楚。在植物中检测到的最突出和独特的 p450 活性是反式 - 苯乙烯酸羟化酶 t-cah 活性(schuler, 1996)。这种酶在苯基异丙酮途径中跟随在苯基丙氨酸解氨酶 pal 之后，催化苯乙烯酸到对香豆酸的转变。细胞色素 p450单氧酶基因在豌豆中为损伤所诱导表达(frank et al., 1996)。1.2.4 信号途径

39、基因1.2.4.1 脂肪氧合酶（ lipoxygenase, lox）基因lox是真核细胞中普遍存在的酶，将长链不饱和脂肪酸氧化成它们的过氧化合物。脂肪氧合酶基因的表达是伤口和病原物攻击诱导的，是植物内源防御体系的一部分。如在大豆、马铃薯上的 lox mrna 积累可由昆虫攻击引起。在植物中 lox 参与激素茉莉酮酸酯的合成，从而调控植物对损伤的反应。在番茄叶片上，tomloxd 基因的表达可由损伤诱导，tom-loxd 解码的叶绿体 lox 是类十八烷防御信号途径的一个组成成分，在植物的害虫防御中起作用。马铃薯中 lox-h3 基因的反义缺失使得马铃薯降低 pin 损伤诱导水平，提高取食害虫

40、的重量。1.2.4.2 丙二烯氧化合成酶（ allene oxide synthase,aos）基因丙二烯氧化合成酶催化游离脂肪酸氧化衍生的过氧化氢物生物合成丙二烯环氧化物，提供植物激素茉莉酮酸酯合成的前体(sivasankar et al., 2000)。在番茄叶片上，损伤可诱导丙二烯氧化合成酶基因表达(sivasankar et al., 2000)，在拟南芥上也有同样情况 (laudert and weiler, 1998)。在亚麻(linum usitatissimum)中，机械损伤可提高受害叶和远离受害叶的植物组织的 aos 基因的表达。损伤诱导的 aos 基因表达的积累需要重新生物

41、合成参与调控 aos 基因表达的信号传输途径的蛋白质，而且aos mrna 的积累与茉莉酮酸酯水平的提高相关16。损伤引起细胞质的 aos 提高茉莉酮酸酯的水平，由此来间接或直接提高植物防御基因的表达。其它基因还有一些基因被损伤或昆虫取食诱导表达，但是具体的功能未确定。如在野生型拟南芥上，损伤快速诱导 coronatine 诱导的基因 (benedetti et al.,1998)；在拟南芥上，损伤诱导的响应茉莉酮酸酯的基 因 jr1、jr2 和 jr3 和 响 应 损 伤 的 基 因。外界胁迫因子如水分、盐度和紫外光等的胁迫也能影响植物防御害虫的基因表达。大豆幼苗水分的缺失导致 loxa 和

42、 loxb 的快速积累，同样大豆萎蔫时，loxa和 loxb mrna 也快速提高17。盐度和水分缺失程度的增加正向调控 lapa 和 le4基因的表达。烟草在受到紫外光的照射后的转录反应与 manduca sexta 诱导的植物防御反应具有很多相似之处，正向和负向调控相同的基因。这些研究表明植物对害虫和其他胁迫因子的防御反应可能分享相同的信号途径。1.3 本研究目的意义植物的防御反应是由一系列的信号分子和转录调节子所调节的一个复杂的网络。至今，已经有了很多的研究表明植物体内的水杨酸、茉莉酸、过氧化氢以及乙烯等信号分子在植物的虫害诱导防御反应中起到了重要的作用。但醇类化合物对植物的防御反应的影

43、响鲜见报道。本研究以香叶醇和叶醇诱导的番茄果实为材料，通过测定果实多酚氧化酶活性和防御相关基因的表达，研究了醇诱导下番茄果实的防御反应，为了解番茄果实的次生代谢及受伤防御反应奠定一定的理论基础。第2章 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 植物材料野生型番茄(solanum lycopersicum mill. cv. ailsa craig)红熟果实2.1.2 pcr引物序列2.1.3 生化及分子生物学试剂香叶醇、叶醇、磷酸缓冲液、邻苯二酚等各种试剂均为国产分析纯。trizol：invitrogen公司反转录试剂盒：takara公司。realmastermix(sybr green)试

44、剂盒（tiangen biotech公司）：成都博瑞克生物技术有限公司。2.1.4 仪器和设备研钵、容量瓶、玻璃棒、培养皿、10ml离心管、刀片、胶头滴管、恒温箱、eppendorf research 10l-100l移液器、北京普析tu-1900双光束紫外可见分光光度计、eppendorf research 100l-1000l移液器、sg超纯水器、sartorius万分之一电子天平、bio-red 荧光定量pcr仪2.2 实验方法2.2.1 ppo多酚氧化酶的比活性测定1) 材料处理 使用10mm浓度的叶醇、香叶醇分别喷施在番茄成熟果实表面，室温下放置1-3 天，同时利用果盘法，将果实切片

45、直接暴露于醇溶液中1-3天。处理结束后，立即提取果实粗酶液，测定多酚氧化酶活性；将剩余的样品经液氮冷冻后，置于-80冰箱内保存。2) 粗酶液制备 将洗净的研钵放入冰箱冷冻室（-20）中预冷 4h，然后将4g样品分别放入加有 4ml ph6.24 的磷酸缓冲提取液的研钵中进行研磨，研好的样品分装于 1.5ml 的离心管中，并在 10，000rpm/min 的条件下离心 20min，取上清液即为 ppo 的粗酶液。ph6.24磷酸缓冲提取液：母液a: 0.2 mol/l na2hpo4 溶液。将71.64g的na2hpo412h2o用蒸馏水溶至1000ml。母液b：0.2 mol/l nah2po

46、4 溶液。将71.64g的用蒸馏水溶至1000ml。配法 a：22.5（ml） b：77.5 （ml）稀释至 ml0.5%邻苯二酚：取0.5g的邻苯二酚溶至100ml,将得到0.5%邻苯二酚溶液。3) 比色 吸取 500l ph6.24磷酸缓冲液和1000l0.5%邻苯二酚到 2ml 试管中，将试管放入到 37恒温箱中，待反应10min后，分别加入 0.5ml酶液，反应1.5min后分别在410和525两个波长下测定吸光值（a值）；实验中以煮过失活的酶液为空白对照。2.2.2 防御相关基因的诱导表达情况2.2.2.1 rna专用试剂和耗材的处理在rna实验过程中，任何环节的不正确操作都可能导致

47、rna酶的污染。由于rna酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应全程戴1次性手套和口罩，因为皮肤上的细菌和霉菌及口腔中的唾液常常是外源性rna酶的重要来源。玻璃器皿：在160c的烘箱中烘烤4 h以上。塑料器皿：在0.5 mol/l naoh中浸泡10 min，用无rna酶的水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。水：将水加入无rna酶的玻璃瓶中，加入depc至0.01% (v/v)，37c放置过夜并高压灭菌。sds及tris溶液：取新开封的药品，用depc处理过并经高压灭菌的水配制。其他试剂：试剂配好后，加入depc至0.01% (v/v)，37c过夜并高压灭菌。电泳装置：用清洁

48、剂清洗后用流水冲洗，1% naoh浸泡过夜，depc处理并灭菌过的水彻底冲洗后用无水乙醇清洗干燥。2.2.2.2 果实rna的提取1) 取-80冰箱内保存的处理过的番茄果实2-4克，加入液氮研磨成粉状，迅速转移100-200mg粉末于不含rnase的1.5 ml ep管中，即刻加入1 ml trizol， 在vortex上振荡10s，然后将匀浆样品在室温孵育5 min以使核蛋白体完全分解；2) 加0.2 ml氯仿，盖紧ep管盖，用手剧烈振荡15 s并于室温孵育2-3 min；3) 4c，12,000 g离心15 min。离心后混合物分成3层：下层红色的为苯酚-氯仿层，中间层为细胞残渣，上层无色

49、的为水相层，rna存在于水相层中，水相层的容量大约为所加trizol容量的60%；4) 将水相层转移到1干净的1.5 ml ep管中，加入0.6 ml异丙醇，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10 min；5) 4c，12,000 g离心10 min。倒掉上清液，用75%的乙醇1 ml洗涤rna沉淀1-2次，旋涡振荡混合样品后，4c，7,500 g离心5 min；6) 倒掉乙醇，常温干燥rna沉淀10 min，加入50 l无rna酶的h2o，并于55c孵育5 min，以使rna充分溶解；7) 取5 l rna样品进行琼脂糖凝胶电泳检测；8) 取5 l rna样品，加495 l无rna酶的te缓

50、冲液(ph 8.0)稀释后，用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm处的吸收值，分析其纯度和浓度。2.2.2.3 荧光定量pcr分析1）逆转录：将各个rna样品的浓度调整为200 g/ml，于 0.5 ml ep管中，40 l反应体系：10 l rna 1 l polyt18 (10 mol/l)18 l h2o混匀，短暂离心后70c温育5 min，迅速置冰浴中，加样如下：1 l rnase inhibitor1 l dntp (10 mmol/l)8 l 5 buffer1 l mmlv reverse transcriptase混匀，短暂离心，42c 1 h，70c 10 min灭

51、活逆转录酶，-20c保存样品。2）real-timepcr反应:用realmastermix(sybrgreen)试剂（tiangenbiotech公司）进行，每组样品重复三次。pcr采用20l体系，其组成为：2.5realmastermix9lforward primer (10 m)1lreverse primer (10 m)1lcdna模板1lrnase-free ddh2o8l反应程序为： 95预变性90s； 95变性10s； 55退火10s； 68延伸15s； 40个循环。 实验采用相对定量的方法，分析目的基因在样品组与对照组间差异表达的倍数（rel.quantity）。本实验以p

52、eactin基因作为内参照，将其ct值和靶基因ct值填入基因表达相对值分析软件rest18进行分析计算，同时算出标准误差。第3章 结果与分析3.1 香叶醇和叶醇的诱导对番茄果实多酚氧化酶活性影响多酚氧化酶(ppo)是催化酚类氧化的各种酚酶的总称，通常包括多酚氧化酶、络氨酸酶和儿茶酚酶。植物来源的 ppo 是一种寡聚体，每一个亚基含有一个铜离子作为辅基。ppo 在 ph 57 之间具有活性，但没有明显的最适 ph;在低于 ph 3 时，ppo 不可逆的失活。研究已经表明，ppo 含量和活性是组织产生褐化的内在原因，它与植物的防御反应有关。ppo酶活性的分析多是通过分光光度法测定的。在本实验中，通

53、过波长扫描，确定了两个波长410和525nm下，均存在较高的吸收峰。因此本实验中，两个吸收峰下的吸光值的变化均被分析。图1 香叶醇和叶醇诱导下番茄果实的ppo比活性（525nm波长）从图1可以看出，与未处理的对照相比，喷施10mm香叶醇和叶醇均引起多酚氧化酶活性的提高，且随处理时间的延长，酶活性也明显增加。叶醇处理1d和3d时，多酚氧化酶比活性(525nm波长下)为3.26和4.59，与对照相比，增加了1.3和2.3倍；而香叶醇处理1d和3d的仅增加了0.97和1.14倍。将果实切片直接暴露在醇溶液中测定的多酚氧化酶比活性为3.51和6.35，对ppo酶活性的诱发明显高于喷施处理。图2 香叶醇

54、和叶醇诱导下番茄果实的ppo比活性（410nm波长）从图2可以看出，与未处理的对照相比，喷施10mm香叶醇和叶醇均引起多酚氧化酶活性的提高，且随处理时间的延长，酶活性也明显增加。叶醇处理1d和3d时，多酚氧化酶比活性(410nm波长下)为5.09和11.86，分别是对照组的2.3和5.3倍；而香叶醇处理1d和3d后测得的多酚氧化酶比活性仅是对照组的2.2和2.4倍。将果实切片直接暴露在香叶醇和叶醇溶液中测得的ppo酶活性分别为9.35和12.86，诱发明显高于上述的喷施处理。尽管在410nm下测定的ppo酶活性，在数值上与在525nm下测定值存在较大的差异，但整体的趋势是一致的，表明这两个吸收

55、波长均可被用来测定ppo酶活性的变化。结果表明，与香叶醇相比，叶醇处理对果实的伤害作用更为明显，引发了更多的多酚氧化酶活性的提高。3.2 醇处理对防御相关基因lox, cdi, ps, inhii表达的影响3.2.1 荧光定量pcr扩增效率、相关系数和溶解曲线图3基因的扩增曲线在荧光定量pcr仪上，通过荧光定量pcr获得了基因的扩增曲线。由该溶解曲线可以看出， pcr反应呈指数增长，表明该pcr体系是符合实验要求。3.2.2 醇诱导对lox基因表达的影响脂肪氧合酶（ lipoxygenase, lox）基因是真核细胞中普遍存在的酶，能将长链不饱和脂肪酸氧化成它们的过氧化合物。脂肪氧合酶基因的表

56、达是伤口和病原物攻击诱导的，是植物内源防御体系的一部分(felton et al., 1992)。如在 arabidopsis(belland mullet, 1993)、大豆(sarawitz and siedow, 1996)、马铃薯(royo et al., 1996)上的 lox mrna 积累可由昆虫攻击引起。在植物中， lox 参与激素茉莉酮酸酯的合成，从而调控植物对损伤的反应。在番茄叶片上，tomloxd 基因的表达可由损伤诱导，tom-loxd 解码的叶绿体 lox 是类十八烷防御信号途径的一个组成成分，在植物的害虫防御中起作用(heitz et al., 1997)。马铃薯中

57、 lox-h3 基因的反义缺失使得马铃薯降低 pin 损伤诱导水平，提高取食害虫的重量。可见lox基因的表达水平与植物的防御反应相关。图4 醇诱导对lox基因表达的影响从图4可以看出，与叶醇处理番茄果实1d后的lox基因表达相比，香叶醇处理1d和3d时，其相应的lox基因相对表达量为1.15和0.41，仅占叶醇处理1d时的80%和30%。叶醇处理3d时，其相应的lox基因相对表达量占叶醇处理1d的2%。香叶醇和叶醇浸泡组的lox基因相对表达量分别占叶醇处理1d的75%和7%。结果表明lox属于早期基因，随着香叶醇或叶醇处理的时间延长，经过醇诱导的lox基因表达量越低。 3.2.3 醇诱导对cdi基因表达的影响组织蛋白酶抑制剂(cdi)与植物