用紫外光谱分析测定饮料中咖啡因的含量

1、酒酒 泉泉 职职 业业 技技 术术 学学 院院 毕毕 业设计（论业设计（论 文）文） 0 9 级 石油化工生产技术 专业 题 目： 用紫外光谱分析测定饮 料中咖啡因的含量 毕业时间： 2012 届毕业生 学生姓名： 指导教师： 班 级： 09 石化（1）班 2011 年 3 月 5 日 酒泉职业技术学院 2 0 1 2 届各专业 毕业论文（设计）成绩评定表 姓名屈永德班级09 石化（1）班专业石油化工生产技术 指导教 师第一 次指导 意见 论文内容基本符合要求，在第一章中将紫外分光光度计的组成融合到仪器 构成当中；表格需注明序号及标题，置于表格上方居中；插图注明序号及标题， 置于插图下方居中；

2、将出现的公式用公式编辑器写规范；将剪切过来的表格全 部画出来；另外注意文章排版按照学校要求的，其次，使文章内容连贯得体。 2011 年 5 月 25 日 指导教 师第二 次指导 意见 论文符合要求，但要注意论文中的标点符号的正确应用；其次论文在排版 上要多下功夫，将第一章中的紫外风光光度法的应用分四部分写，先写定量， 再写定性，最后写再其它方面的应用，论文中的公式要重新编写，认真的读论 文，要善于发现里面的错别字，修改错别字。 2011 年 6 月 2 日 指导教 师第三 次指导 意见 指导教 师评语 及评分 成绩： 签字（盖章） 年 月 日 答辩小 组评价 意见及 评分 成绩： 签字（盖章）

3、 年 月 日 教学系 毕业实 践环节 指导小 组意见 签字（盖章） 年 月 日 学院毕 业实践 环节指 导委员 会审核 意见 签字（盖章） 年 月 日 说明：1、以上各栏必须按要求逐项填写.。2、此表附于毕业论文 (设计)封面之后。 目录目录 前言.6 一 紫外可见分光光度计概述.7 （一） 分光光度法原理 .7 （二） 分光光度仪构成 .8 1 辐射源.8 2 进样装置单色器.8 3 光源.9 4 反应池（吸收池）.9 5 检测系统.9 （三） 紫外可见分光光度法特点 .9 1 应用广泛.9 2 灵敏度高.10 3 选择性好.10 4 准确度高.10 5 适用浓度范围广.10 6 分析成本低

4、、操作简便、快速.10 （四）紫外可见分光光度法的应用 .10 1 光谱分析.10 2 紫外可见分光光度法定性分析.11 3 紫外可见分光光度法定量分析物质含量.13 4 在其它方面的应用.15 二 紫外分光光度法测饮料中咖啡因的含量.16 （一） 实验药品及仪器 .16 1 药品.16 2 仪器.17 （二） 实验分析步骤 .17 1 样品的处理.17 2 标准曲线的绘制.18 3 测定.18 （三） 实验结果 .19 1 计算.19 2 本实验条件下.19 3 允许差.20 （四） 实验条件的选择 .20 1 吸收曲线.20 2 pH 的影响 .20 3 氯化钠对方法的影响.21 4 萃取

5、时间.22 5 提取溶剂的使用量.22 6 方法精密度.23 （五） 结果与讨论 .24 1 标准曲线.24 2 咖啡因分析条件的优化.24 致谢.27 参考文献.28 摘要摘要 咖啡因广泛应用于当今许多碳酸饮料和能量饮料中。随着可乐饮料如可口 可乐，百事可乐等在全世界的风靡，各种可乐饮料已经成为人们饮食当中摄取咖 啡因次数较高的一个重要来源，但大量或长期摄取咖啡因有损人体的健康。因此,各 国对饮料中咖啡因的含量都做出了相应的规定和限制。现有的咖啡因分析方法中， 光谱分析方法简单，直接，但很难避免样品基质和其它物质的干扰，所得结果往 往有较大误差；色谱及色谱质谱联用分析方法准确、灵敏度高，但往

6、往样品前处 理步骤繁琐，需要使用大量的有机溶剂，分析时间较长，所需的分析费用也相对 较高。因此，发展一种简便、有效、经济、环保的分析方法用于饮料中咖啡因的 日常质量控制和法规检测显得尤为重要。 本论文采用紫外光谱分析方法测定饮 料中咖啡因的含量。该方法简单快速、稳定、准确、灵敏度高、干扰物排除能力 强，同时也是对所学知识的一种巩固运用。 关键词：关键词：紫外分光光谱法；饮料；咖啡因；测定； 前言前言 咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为 1，3，7三甲基黄嘌呤，为白色无臭味苦的发亮针丝状或粉末结晶。熔点为 234 -238 ，178升华，能溶于乙醚、丙酮、氯仿、

7、水，微溶于石油醚。以往 咖啡因常采用容量法，因操作复杂不太理想。实践证明本方法简单快速好，可用 于可乐型饮料中咖啡因的测定。 咖啡因具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖 啡因在饮料中的食品卫生标准。美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料 中咖啡因的含量不得超过 200mg/L，南斯拉夫规定不得超过 120mg/L，到目前为 止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过 150mg/Kg，为了加 强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。 紫外分光光度法是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定 方法。其方法简单、快速、准确。最低检出浓度

8、：紫外法对可乐型饮料为 3mg/L；对咖啡、茶叶及其固体制品为 5mg/100g；对咖啡和茶叶的液体制品为 5mg/L。 一一 紫外可见分光光度计概述紫外可见分光光度计概述 （一）（一） 分光光度法原理分光光度法原理 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度， 对该物质进行定性和定量分析的方法。 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便 可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（）为横坐标，吸收强度 （A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、 定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色

9、物 质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见 光光度法。它们与比色法一样，都以 Beer-Lambert 定律为基础。 上述的紫外光 区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红 外光区。 当一束强度为 I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸 收,因此透射光的强度降至 I，则溶液的透光率 T 为：I/I0 根据朗伯（Lambert）-比尔（Beer）定律: A=abc 式中 A 为吸光度，b 为溶液层厚度（cm） ，c 为溶液的浓度（g/dm3） ， a 为 吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶

10、液中其他 组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，当固定溶液层厚度 L 和吸光系数时，吸光度 A 与溶液的浓度成 线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光 谱） ，从中确定最大吸收波长，然后以此波长的光为光源，测定一系列已知浓度 c 溶液的吸光度 A，作出 A-c 工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度 A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。 上述方法是依据标准曲线法来求出未知浓度值，在满足要求（准确度和精密 度）的条件下，可以应用比较法求出未知浓度值。 （二）（二） 分光光度仪分光光度仪构成构成 依据分光光

11、度法测量原理，把比较法应用到仪器之中浓度直读功能。用 标准溶液将仪器调整好，再测定样品时，直接显示样品浓度值。 1 1 辐射源辐射源 自动检测仪器的核心组成部分，通过运行检测程序和链接显示器以及其他外 部设备，实现在线自动检测、数据储存于采集、远程控制等。 辐射源必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光 谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围 3502500 纳米） ，氘灯或氢灯（180460 纳米） ，或可调谐染料激光光源等。 2 2 进样装置进样装置单色器单色器 蠕动泵和九通阀实现多个反应试剂及样品的进液，计量装置控制反应试剂及 样品进样量。 单色器它由入射、出射狭缝、透镜系统和

12、色散元件（棱镜或光栅）组成，是 用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光 和分出所需的单色光束。 3 3 光源光源 发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。 （稳压装置） 4 4 反应池（吸收池）反应池（吸收池） 检测时的化学反应均在反应池内进行，反应结束后被测试液将由检测系统将 信号传输并分析。因此，反应池有两个作用：一是作为分光光度检测的化学反应 装置；二是作为分光光度检测的比色皿。玻璃比色皿能吸收紫外光，仅适用于可 见光区；石英比色皿不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。试样容器，又称吸 收池，供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，

13、前者适用于 紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为 0.510 厘米。 5 5 检测系统检测系统 将通过被测试液吸收后的光信号(强度)放大，并通过显示器以数值形式显示 出来，该过程中应该注意，由于随机误差原因，比较法准确度相对于标准曲线法 要差一些，另外标准溶液与被测溶液浓度相差太大时有较大误差和显色反应与显 色条件。检测器，又称光电转换器，常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者 更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。近年来还使用光导摄像管或光电二极管矩 阵作检测器，具有快速扫描的特点。 （三）（三） 紫外可见分光光度法特点紫外可见分光光度法特点 分光光度法对于分析人员来说，可以说是最

14、有用的工具之一。几乎每一个分 析实验室都离不开紫外可见分光光度计。分光光度法的主要特点为： 1 1 应用广泛应用广泛 由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加 以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和 惰性元素之外）均可采用此法。 2 2 灵敏度高灵敏度高 由于相应学科的发展，使新的有机显色剂的合成和研究取得可喜的进展，从 而对元素测定的灵敏度大大提高了一步。特别是由于多元络合物和各种表面活性 剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到几十万。相对于 其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和准确度一致公认是比较高的。不但在 实

15、际工作中光度法被广泛采用，在标准参考物质的研制中，它更受重视，很多光 度分析法已制定成为标准方法。 3 3 选择性好选择性好 目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如 钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。 4 4 准确度高准确度高 对于一般的分光光度法来说，其浓度测量的相对误差在 1-3%范围内，如采 用示差分光度法测量，则误差往往可减少到千分之几。 5 5 适用浓度范围广适用浓度范围广 可从常量（1-50%） （尤其是使用示差法）到恒量（10-6-10-8%） （经预富集 后） 6 6 分析成本低、操作简便、快速分析成本低、操作简便、快速 （四

16、）紫外可见分光光度法的应用（四）紫外可见分光光度法的应用 1 1 光谱分析光谱分析 有时候需要研究某物质在某溶剂中的光谱特性，如 Vc 的乙酸溶液在 252.0 nm 和 237.5nm 处有吸收波峰。 大多数情况下，比色分析都提供了使用光的波长（一般是最大吸收峰波长） 。 如果没有提供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从 2001000nm 范围内扫 描吸收光谱，搜索到吸收峰，再用吸收峰波长来比色分析。 咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品。 图图 1 咖啡因样品用紫外光谱定性和定量图 2 2 紫外可见分光光度法定性分析紫外可见分光光度法定性分析 （1 1） 可作为物质定性的

17、参考可作为物质定性的参考 被测物质的光谱特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查 VB12注射液 是否变质，测定其光谱，结果为 2790；361.50；550.70.3nm 个吸收峰， 完全一致，可以判定该物质为 VB12（未变质） 。 表表 1 一些苯衍生物的紫外光谱特征如下表所示 化合物 溶剂 吸收峰吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物 254nm250 nm 204 nm 8800 nm 甲苯 碳氢化合物 262 nm260 nm 208 nm 7900 nm 六甲基苯 碳氢化合物 271 nm230 nm 221 nm 10000 nm 氯苯 碳氢化合物 267 nm

18、200 nm 210 nm 7400 nm 苯酚 碳氢化合物 271 nm1260 nm 213 nm 6200 nm （2 2） 用于有机化合物的定性和结构分析用于有机化合物的定性和结构分析 紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的性质和结构，所以可以用于有机 化合物的定性和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对未知化合物进行鉴定， 即控制相同的测量条件，将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图谱进行对照， 如果两者吸收光谱的形状、吸收峰的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全 一致，则可说明它们分子结构中存在相同的生色基团，初步确定它们是同一种物 质，如咖啡因的定性。由于大多数有机化合物的紫外

19、光谱比较简单，缺乏精细的 结构特征，而且很多生色团的吸收峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因 此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局限，一般必须与红外光谱、质谱、 核磁共振波谱等相配合，才能进行精确的鉴定。 在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非 极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷） ，以获得吸收光谱 的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的 溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与 溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可 忽略。 表表 2 常用溶剂的

20、波长范围如下 溶 剂使 用 波 长 范 围溶 剂使 用 波 长 范 围 甲 醇210二 氯 甲 烷 235 . 乙 醇210氯 仿 235 . Comment S1: 重新输入 水210乙 酸 乙 酯 235 . 96% 硫 酸210苯 235 . 乙 醚210甲 苯 235 . 3 3 紫外可见分光光度法定量分析物质含量紫外可见分光光度法定量分析物质含量 （1 1） 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 朗伯-比尔定律中的 K 称为吸光系数。因比色杯的直径用 cm 为单位，因此 K 的单位决定于浓度 c 用什么单位，如 c 以 mol/L 为单位时 K 称为摩尔吸光系 数，用 Emol或 mol表

21、示；如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K 称为百 分吸光系数，用 E%表示。 E 的定义是：某波长光通过 1cm 杯、1mol/L 或 1%浓度的某溶液时，该溶液 对该波长光的吸光度。E 在特定波长、1mol/L 或 1%浓度、特定溶剂条件下是该 物质的一个特征常数，反映该物质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征波 长或最大吸收波长，表示为或E%nm，max，1cm。许 % 1max,cmnm E波长 % 1max,cmnm E波长 多物质的吸光系数在书或资料中可以查到，如药典规定 VB12应该有 2781 nm、3611nm、5502nm 3 个吸收峰，其 E1%361nm，1cm=

22、207。实际工作中， 1mol/L 的浓度太高，可以配成 1mmol/L 或 1mol/L 的浓度，相应地写成 Emmol（mol）nm，max，1cm。 （2)2) 紫外可见分光光度法定量分析紫外可见分光光度法定量分析 根据吸光系数的特性 ，它有 4 项用途： 检查纯度: 紫外光谱法检查纯度是一种简便有效的方法，用于许多化合物检测。 如阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在 280nm 处有强吸收 峰，而水杨酸的吸收峰迁移到 312nm，只要检测在 312nm 处是否有吸收峰，即 可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留 苯，测定其吸收光谱，乙醇在

23、210600nm 之间无吸收峰，而苯在 250、254 nm 有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在 250、254nm 处 出现吸收峰，则说明有苯残留。 检查含量（纯度）:如药典规定 VB12的 E1%max，361nm，1cm=207，上述 VB12注 射液原标示浓度为 0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释 20 倍， 水做参比，用 361nm 测定的吸光度为 0.512，其含量为：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，浓度= 0.00247%20=0.049% 应用摩尔吸光系数测定浓度: 一般的比色分析中都有标准品，未知样品都是 通过和标准

24、溶液对比分析含量。某些情况下，没有标准品，可以用摩尔吸光系数 或百分吸光系数进行测定，直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的吸光系数 比较，可以计算出浓度。这样的分析需要经过精确校正了波长的分光光度计，紫 外分光光度计的波长一般精确到 2nm，可以承担这样的分析。如果知道分子量 的话，百分吸光系数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公式是：百分吸光 系数=10摩尔吸光系数物质的分子量。 比如血红蛋白是 4 个亚基组成的蛋白质，单个亚基的平均分子量是 16114.5。每个亚基都在高铁氰化钾K3Fe(CN)6和氰化钾KCN溶液中形成单体 氰化高铁血红蛋白（HiCN） ，它的特征（最大）吸收峰在 5

25、40nm 处，摩尔吸光 系数是 11000，表示为 Emolmax,540nm,HiCN=11000。 测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算出含量。如：将血液 0.02ml 加入到 5.0ml 氰化高铁试剂中，用 540nm 测定的吸光度为 0.35，求血液中 Hb 的 含量（g/L） 。第一步，计算血液稀释倍数：5.020.02=251（倍） ；第二步，计算： 1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为 g， x=0.351100016114.5 251=128.7（g/L） 。如果有些物质不知分子量，用它的 1%溶 液在同样条件

26、下测定，用百分吸光系数同样可以换算。 作为光度计使用：有色的反应液可以用普通的分光光度计（721、722、浓度 计） ，也可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应液无色，在 200400nm 之间有特征性光吸收，就只能用紫外分光光度计。 1. 单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一般用最大吸收波长进行比色。常 用方法有 2 种: （1）标准曲线法：用标准液制作一系列标准管的标准曲线，样品测定结果查标 准曲线求知。 （2）对照管法：制作标准测定管和样品测定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰） 处测定吸光度进行比较，可直接求出样品含量。如 VB12含量测定：精确吸 VB12 注射液 Vml，加重蒸水稀

27、释 n 倍，使每含的标示量为 30g/ml，另外配 VB12标准 液浓度为 30g/ml，蒸馏水调零，用 361nm 测定吸光度 A，计算：测定液中 VB12 含量（g/ml）=（A样品/A标准品）30；注射液中 VB12含量（g/ml）=（A样品/A 标准品）30 n（稀释倍数）V（取样量，ml） 。 2. 混合物中两物质同时测定（两物质的最大吸收峰有部分重合） ，例四环素和金 霉素混合物的测定：四环素在 0.25 N NaOH 中最大吸收峰为 380nm，E1%1cm，max =372.0；在 0.1N HCl 中最大吸收峰为 355nm，E1%1cm，max =303.2 ；两吸收峰都可

28、以做为四环素的测定波长。但与金霉素共存时，因为金 霉素在 355nm 处有吸收（金霉素在 0.1N HCl 中 E1%1cm，max =182.6） ，只能用 380nm 测定四环素。混合样品在 355nm 处测定二者的总吸光度，在 380nm 处测 得四环素的吸光度，则两者的浓度都可以求出。测定方法： （1）测定 1%混合物在 0.1N HCl 溶液的吸光度 A335 （2）测定 1%混合物在 0.25N NaOH 溶液的吸光度 A380，计算：四环素浓度 C1（g%）= AC1380 / E1%（C1）1cm，380= AC1380 / 372.0 金霉素浓度 C2（g%） =AC1+C2

29、335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC1380372.0）182.6 4 4 在其它方面的应用在其它方面的应用 紫外光度法广泛应用在化学、生物化学、医学、环境检测、食品卫生检验分 析方面。凡在 200-1000nm 范围内有特征性吸收，或与试剂反应后形成特征性吸 收，符合郎伯比尔定律的，都可以分析。如： (1)(1) 测定蛋白质：测定蛋白质：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸对 280nm 的紫外线有最大吸收， 吸收值与其浓度成正比，样品不必反应，稀释后直接测定。 (2)(2) 肌红蛋白：肌红蛋白：在 576nm 附近有吸收峰，

30、不需要标准品，通过摩尔吸光系数法， 可直接测定。 (3)(3) 还原性谷胱甘肽：还原性谷胱甘肽：与四氧嘧啶反应，生成物在 305nm 处有最大吸收峰。 (4)(4) 过氧化氢酶：过氧化氢酶：有可见光测定法，也有紫外法。 (5)(5) 抗生素：抗生素：大部分可用紫外法测定，如青霉素、链霉素、氯霉素、四环素、金 霉素、新生霉素。 (6)(6) 许多药物要用紫外光谱测定：许多药物要用紫外光谱测定：如咖啡因用 272.6nm；巴比妥类（安眠药）用 220240nm 测定；5 种氯丙嗪类药（镇定药）全用 249307nm 测定；安眠酮用 235 和 503nm 分析；安定（镇静药）用 240 和 285

31、nm 分析。 (7)(7) 用于紫外比色测定：用于紫外比色测定：食品中硒与邻苯二胺反应，将络合物提取到甲苯中，反 应物在 335nm 左右有吸收峰，用紫外比色测定。 二二 紫外分光光度法紫外分光光度法测饮料中咖啡因的含量测饮料中咖啡因的含量 （一）（一） 实验药品及仪器实验药品及仪器 1 1 药品药品 本实验所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。 （本实验所有试剂均 由酒泉职业技术学院化学工程系实验室提供） （1 1）无水硫酸钠无水硫酸钠 （2 2）三氯甲烷三氯甲烷使用前重新蒸馏 （3 3）1.5(m/v)1.5(m/v)高锰酸钾溶液高锰酸钾溶液: : 称取 1.5g 高锰酸钾，用水溶解并

32、稀释至 100mL。 （4 4）亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液: : 称取 10g 无水亚硫酸钠(Na2SO3)，用水 溶解并稀释至 100mL，另取 10g 硫氰酸钾，用水溶解并稀释至 100mL，然后二者 均匀混合。 （5 5）15%(V/V)15%(V/V)磷酸溶液磷酸溶液: : 吸取 15mL 磷酸置于 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻 度，混匀。 （6 6）20%(m/V)20%(m/V)氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液: : 称取 20g 氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至 100mL。 （7 7）20%(m/V)20%(m/V)醋酸锌溶液醋酸锌溶液: : 称取 20

33、g 醋酸锌Zn(CH3COO)22H2O加入 3mL 冰 乙酸，加水溶解并稀释至 100mL。 （8 8）10%(m/V)10%(m/V)亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液: : 称取 10g 亚铁氰化钾。K4Fe(CN)63H2O用 水溶解并稀释至 100mL。 （9 9）咖啡因标准品咖啡因标准品: : 含量 98.0%以上。 （1010）咖啡因标准储备液咖啡因标准储备液: : 根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成 每 mL 相当于 0.5mg 咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。 2 2 仪器仪器 紫外分光光度计。 （二）（二） 实验分析步骤实验分析步骤 1 1 样品的处理样品的处理 （1 1）

34、 饮料饮料:在 250mL 的分液漏斗中，准确移入 10.0mL 经超声脱气后的均匀可 乐型饮料试样，加入 1.5%高锰酸钾溶液 5mL，摇匀，静置于 5min，加入混合溶 液 10mL，摇匀，加入 30mL 重蒸三氯甲烷。振摇 100 镒，静止分层，收集三氯 甲烷。水层再加入 10mL 重蒸三氯甲烷，振摇 100 次，静置分层。合并二次三氯 甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至 100mL，摇匀，备用。 （2 2） 咖啡、茶叶及其固体制成品咖啡、茶叶及其固体制成品: :在 100mL 烧杯中称取经粉碎成低于 30 目的 均匀样品 0.52.0g，加入 80mL 沸水，加盖，摇匀，浸泡 2h，然

35、后将浸出液全 部移入 100mL 容量瓶中，加入 20%醋酸锌溶液 2mL，加入 10%亚铁氰化钾溶液 2mL，摇匀，用水定容至 100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液 5.020.0mL 按 5:1:1 操作进行，制备成 100mL 三氯甲烷溶液，备用。 （3 3）咖啡或茶叶的液体制成品：）咖啡或茶叶的液体制成品：在 100mL 容量瓶中准确移入 10.020.0mL 均 匀样品，加入 20%醋酸锌溶液 2mL，摇匀，加入 10%亚铁氰化钾溶液 2mL，摇 匀，用水定容至 100mL，摇匀，静置沉淀，过滤；取滤液 5.020.0mL 按 5:1:1 操作进行，制备成 100mL 三氯甲烷溶

36、液，备用。 2 2 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 从 0.5mg/mL 的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为 2. 00 ，4. 00 ，6. 00 ，8. 00 ，10. 00 ，12. 00 ，14. 00g/mL 的标准系列，以 0g/mL 作参比管，调节零点，用 1cm 比色杯于 276.5nm 下测量吸光度 A，得出 吸光度-咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。 图图 2 咖啡因标准曲线 3 3 测定测定 在 25mL 具塞试管中，加入 5g 无水硫酸钠，倒入 20mL 样品的三氯甲烷制 备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用 1cm 比色杯于 276.5nm 测出

37、其吸光度， 根据标准曲线（直线回归方程）求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度 C（g/mL） 。这时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。 （三）（三） 实验结果实验结果 1 1 计算计算 % 1max,cmnm E波长 % 1max,cmnm E 波长 可乐型饮料中咖啡因含量 . 1000 1000100 0 V cc l mg 咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(mg/100g) 1000 100100100 1 0 MV CC 咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量(mg/100g) （3） 式中:C样品吸光度相当于咖啡因浓度（g/mL） C0试剂空白吸光度相当于咖啡加浓度（g/mL） m称取样品的重

38、量（g） V 移取样品的体积（mL） V1移取样品处理后水溶液的体积（mL） 2 2 本实验条件下本实验条件下 本法仪器检出限为 0.2g/mL，方法检出限可乐型饮料为 3mg/L，咖啡、茶 叶及其固体制成品为 5mg/100g，咖啡或茶叶的液体制品为 5mg/L。 标准曲线线性范围： 0.030.0g/mL。 相关系数：0.999。 方法回归率：90.1101.8%。 相对标准偏差：4.0%。 3 3 允许差允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料为 10%，咖啡、茶叶及其制品为 15%。 （四）（四） 实验条件的选择实验条件的选择 1 1 吸收曲线吸收曲线 从图

39、3 可见，咖啡因最大吸收峰，在 276.5 毫微米处。 图图 3 咖啡因吸收曲线 2 2 pHpH 的影响的影响 吸取 10 微克标准咖啡因溶液于 50 毫升容量瓶或烧杯中，加水至 45 毫升， 用 0.1NHCI 和 0.1NNaOH 溶液，调节 pH110。然后分别倒人 250 毫升的分液漏 斗中，以下操作按提取(1)进行。结果见图 4。 图图 4 pH 值对提取效果的影响 图 4 说明，pH 值在 110 范围内，对萃取效果，没有明显地差异，其吸光 度稳定。说明 pH 在 110 范围内，对咖啡因没有影响，但萃取咖啡因的最佳 pH 范围为 6.010.0；在 pH6.0 以一下时，当剧烈

40、振摇时，易乳化，分层慢，在 pH6.010.0 没有以上现象。 3 3 氯化钠对方法的影响氯化钠对方法的影响 取含有咖啡因毫克的样品溶液，倒人不同浓度的氯化钠溶液中进行测定，得 到图 5 曲线。由曲线可知，氯化钠的浓度对测定方法，有明显的影响。再使用饱 合盐水 00.3 毫升时，提取时产生乳化现象，测定结果偏低；使用饱合盐水 0.51.5 毫升时，其吸光度的变化，趋于平稳，回收率为 98.5%，故选定饱合盐 水加入量为 1.0 毫升，作为测定条件最宜浓度。加入饱和盐水 1.sml 以上时，产 生大量沉淀物，其测定结果偏低。 图图 5 氯化钠溶液浓度对提取效果影响 4 4 萃取时间萃取时间 萃取

41、摇荡时间的长短，对吸光度值无明响地影响，所以我们选定摇荡时间为 l 分钟。 5 5 提取溶剂的使用量提取溶剂的使用量 根据目前市售可乐型饮料中的咖啡因浓度，取不含咖啡因的可口可乐（预先 将咖啡因全部提出来）100 毫升，加入标准咖啡因 40 毫克，以不同体积的三氯 甲烷分别萃取三次，得到总回收率见表 3。 表表 3 三氯甲烷提取溶剂的使用量（毫升） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 432968 5431277.5 6541589.8 8641896.92 8752099.70 12852599.85 表 3 结果说明

42、，提取剂三氯甲烷使用量，在 18 毫升以上均可提取完全，为 了适应各种可乐型饮料，故将提取溶剂定为 50ml。 6 6 方法精密度方法精密度 为了检查本方法的精密度，根据上述实验条件，得到表 4。 表表 4 咖啡因回收率对比表 样品含咖啡因 （毫克） 加入标准咖啡因 （毫克） 测得总咖啡因 （毫克） 回 收 率 （%） 5.52.07.60101.30 5.52.07.65106.25 5.52.07.4298.93 5.54.09.3896.87 5.54.09.4299.15 5.56.011.2595.8 5.56.011.50100 5.56.011.50100 5.510.015.0

43、095 5.510.015.1396.25 5.510.015.3498.97 5.510.015.2098.06 5.510.015.2597.50 11.01.011.9593.80 11.01.011.9899.83 11.01.012.00100 从表 4 的结果，说明方法的精密度比较高，同时在原料和成品中做出的回收 率是一致的，其平均回收率了 98.61%，标淮偏差 Sx2.70，变动系数 CV2.94。 （五）（五） 结果与讨论结果与讨论 1 1 标准曲线标准曲线 观察咖啡因的标准曲线可知随着咖啡因含量的增加,其在最大吸收波长处的 吸光度也逐渐增加,呈现较好的线性关系.线性方程为:

44、Y= 0.031 74+0.050 62X.相关 系数 r= 0.999 7. 2 2 咖啡因分析条件的优化咖啡因分析条件的优化 （1 1） 溶剂的选择溶剂的选择 准确移取三份 1.0 mL 200 mg/L 咖啡因水溶液于三支 10 mL 比色管中，分别 加入二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯 8.0 mL，充分震荡，萃取后离心分离，取 清液在 250300 nm 波长范围内扫描。比较咖啡因在不同溶剂中的紫外吸收光谱， 可以看出三氯甲烷作溶剂时，吸光度最大，最大吸收峰位于 276 nm。由此可知 三氯甲烷的萃取效率最佳。因此，本实验选用三氯甲烷作溶剂。 （2 2） 样品和溶剂的混合体积比选择样品和

45、溶剂的混合体积比选择 本实验选用 5 mL 溶剂，样品用量分别选 0.35 mL、0.60 mL、1.00 mL，即 体积比分别为 14:1、8:1、5:1 进行测定,结果见表 5。厂家报道的咖啡因含量为:可 口可乐 95.7 mg/L,百事可乐 104.2 mg/L11。从表 5 可以看出 14:1 与 8:1 时所 测得的萃取液中的咖啡因浓度与标准值相近。而 5:1 时测得结果偏低.因此样品 测定中溶剂与溶液的体积比采用 8:1。 表表 5 三氯甲烷与样品不同体积比混合所测得的咖啡因浓度（mg/L） 体 积 比样 品 14:18:15：1 可口可乐（瓶装）90.5790.0585.27 百

46、事可乐（瓶装）101.48101.2597.08 （3 3）样品分析和标准加入的回收率样品分析和标准加入的回收率 用本研究中建立的方法对康师傅绿茶、康师傅红茶、可口可乐(瓶装)、可口 可乐(灌装)、百事可乐(瓶装)、百事可乐(灌装)中的咖啡因含量进行了测定，结果 见表 6。从表 6 可以看出康师傅红茶中所含咖啡因的浓度最小，为 54.29 mg/L； 百事可乐(灌装)所含咖啡因的浓度最大为 118.21 mg/L。 表表 6 饮料中咖啡因浓度测定结果 咖 啡 因 浓 度 mg/L 样 品 第 1 次 测 试 第 2 次 测 试 第 3 次 测 试 平 均 值相对标准 偏 差% 康师傅绿茶98.

47、0092.1698.0096.053.51 康师傅红茶53.1255.4454.3254.292.14 可口可乐 (瓶)89.9287.6091.0489.521.95 可口可乐（罐）92.9492.2499.1294.774.00 百事可乐（瓶）101.3699.12101.36100.611.29 百事可乐 (罐)122.08114.00118.56118.213.43 在 6 种不同的可乐饮料中加入不同浓度的咖啡因标准溶液进行加标回收实验， 结果见表 7。从表 7 可以看出所得回收率的数据在 94.0%112.0%之间，说明该 方法对饮料中咖啡因的分析结果较准确。 表表 7 饮料中加入不

48、同浓度标准咖啡因的回收率测定结果 咖 啡 因 浓 度 mg/L 样 品饮料咖啡因 浓度 加 入 量 （mg/L） 测 得 量 （mg/L） 回 收 率 （%） （mg/L） 1011.5396.09 2020.7093.89 康 师 傅 绿 茶 1.921 4041.1097.95 1011.66105.74 2020.1395.22 康 师 傅 红 茶 1.086 4042.54103.64 1011.3895.90 2020.5693.85 可 口 可 乐 （瓶 装） 1.790 4041.3999.00 1013.10112.05 2022.14101.23 可 口 可 乐 （罐 装）

49、1.895 4042.54101.61 1011.5295.08 2022.72103.54 百 事 可 乐 （瓶 装） 2.012 4041.5398.80 101108.94.36 2022.3099.68 百 事 可 乐 （罐 装） 2.364 4042.0799.27 通过实验得出通过实验得出：用紫外光谱分析法测定了市售饮料中的咖啡因浓度.该方法 具有快速、准确、溶剂消耗少等特点。 致谢致谢 通过这一阶段的毕业论文的最后落笔，我受益匪浅，不仅锻炼了良好的逻辑 思维能力，而且培养了弃而不舍的求学精神和严谨作风。我大学生活也即将画上 一个圆满的句号。回顾这三年的点点滴滴一切都历历在目，让人

50、倍感留恋，倍感 珍惜。是大学三年所学知识很好的总结。 任老师对本论文从选题、构思、资料收集到定稿的各个环节给予悉心指导。 在论文的整个过程中任老师不断把对我得到的结论总结，并提出新的问题，我的 论文才能够继续下去。 此次编制招标文件不仅重温了过去所学知识，而且学到了很多新的内容。相 信这次毕业论文对我今后的工作会有一定的帮助。所以，我很用心的把它完成。 在论文中体味艰辛，在艰辛中体味快乐。 最后，我要感谢我的指导老师任小娜老师，她对我的毕业论文进行了多次的 修改，我的毕业论文才得以顺利完成。同样我也要衷心的感谢养育了我的父母， 感谢教育过和指导过我的各位老师，感谢给予我帮助的朋友们，谨献上我最真挚 的祝福。 参考文献参考文献 1张万明。自茶叶中提取咖啡因实验教学