第三章 发酵液预处理与菌体回收

1、1第三章第三章 发酵液的预处理发酵液的预处理和菌体的回收和菌体的回收2预处理和固液分离内容固液分离固液分离发酵液发酵液胞外胞外上清液上清液/滤液滤液预处理预处理提取生化物质的第一步，分两部分：提取生化物质的第一步，分两部分：胞内胞内富集细胞富集细胞3发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物，及剩余的培养基残分等。谢产物，及剩余的培养基残分等。不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能进行后续进行培养液的预处理和固液分离开，才能进行后续操作：操作：对于胞外产物，

2、可先将菌体或其他悬浮杂质去处，对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去处，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。才能从澄清的滤液中提取代谢产物。对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。碎片分离，然后提取胞内产物。4主要内容主要内容悬浮液的基本特性悬浮液的预处理悬浮液分离过程和分类过滤法过滤的理论基础过滤器的类型过滤器的选择错流过滤51 悬浮液的基本特性悬浮液的基本特性悬浮液 固体颗粒在10-5cm以上的固液分散体系生物细胞培养液 液相,大部分为水；固相,生物体细胞；发酵产物浓度较低，大多为发酵产物浓度较低，大多为1-10%;

3、悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似;可压缩性可压缩性;液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动6为何要对发酵液进行预处理？固液分离方法主要是过滤和离心。固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤度大，不能直接过滤;若用高速离心，能耗很若用高速离心，能耗很大，设备昂贵大，设备昂贵;若用膜分离技术若用膜分离技术(如微滤如微滤)易产易产生膜污染，通量降低。生膜污染，通量降低。

4、发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。72 悬浮液的预处理悬浮液的预处理预处理的目的预处理的目的 促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度等；降低液体黏度等；尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数为液相）；尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数为液相）；相对纯化，去除发酵液中部分杂质（高价无机离子

5、和杂蛋白相对纯化，去除发酵液中部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），质）， 便于后续各部操作；便于后续各部操作；82. 悬浮液的预处理悬浮液的预处理 具体方法具体方法加热法；调节悬浮液的pH值；凝聚和絮凝；使用惰性助滤剂；92.1 加热法加热法把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。加热是发酵液预处理最简单最常用的方法，加热是发酵液预处理最简单最常用的方法，加热能改善发酵液的操作特性，也可以进行加热能改善发酵液的操作特性，也可以进行灭菌。灭菌。适用性：适用性：热稳定性的产物。热稳定性的产物。注意加热温度注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。与时间，

6、不影响产物活性和细胞的完整性。102.1 加热法加热法1 1）加热降低液体粘度）加热降低液体粘度液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的有效措施。流体力学原理过滤速率与液度的有效措施。流体力学原理过滤速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。法和加热法等）可有效提高过滤速率。麦芽汁的黏度麦芽汁的黏度-温度曲线。温度曲线。112.1 加热法加热法2 2）加热使蛋白质变性凝固）加热使蛋白质变性凝固变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至热至80

7、80以上，可使蛋白质变性凝固，过滤以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。速度加快。122.2 调节悬浮液的调节悬浮液的pH值值pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。如利用值可改善其过滤特性。如利用酸碱性来调节酸碱性来调节pH值使蛋白质等两性物质达到等电值使蛋白质等两性物质达到等电点得以除去。点得以除去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。即可

8、减少堵塞和污染。草酸、无机酸或碱草酸、无机酸或碱132.3 凝聚和絮凝凝聚和絮凝均为悬浮液预处理的重要方法，适用于菌体细小而且均为悬浮液预处理的重要方法，适用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。粘度大的发酵液的预处理。 。处理过程：是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变处理过程：是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。特点特点可使颗粒尺寸有效增加可使颗粒尺寸有效增加增大颗粒的沉降或浮选速率增大颗粒的沉降或浮选速率

9、提高滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保提高滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保留作用。留作用。142.3 凝聚和絮凝凝聚和絮凝 概念凝聚凝聚指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。大小块状凝聚体的过程。絮凝絮凝指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架其中絮凝剂主要起架桥作用。桥作用。凝聚剂的作用机理凝聚剂的作用机理 初始粒子表面电荷的简单中初始粒子表面电荷的简单中和；消除双电荷层而脱稳；破坏水化膜

10、；通过氢和；消除双电荷层而脱稳；破坏水化膜；通过氢键或其它复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。键或其它复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。絮凝剂的作用机理絮凝剂的作用机理 架桥作用架桥作用 价格较昂贵价格较昂贵 15发酵液中菌体表面带有发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形在其周围，在界面上形成了双电层。成了双电层。正离子同时受到使它们正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋具有离开胶粒表面的趋势。势。胶体双电层结构16高分子絮凝剂的吸附架桥作用 172.3 2.3 凝聚和

11、絮凝凝聚和絮凝常用凝聚剂常用凝聚剂 无机类电解质无机类电解质 多为阳离子型多为阳离子型无机盐类无机盐类 硫酸铝、明矾、硫酸铁和硫酸亚铁、三氯化硫酸铝、明矾、硫酸铁和硫酸亚铁、三氯化铁、氯化锌、硫酸锌、硫酸镁等铁、氯化锌、硫酸锌、硫酸镁等金属氧化物类金属氧化物类 氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙或石灰氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙或石灰等等聚合无机盐类聚合无机盐类 聚合铝、聚合铁等聚合铝、聚合铁等常用絮凝剂常用絮凝剂 聚丙烯酰胺经不同改性可成为下述三种类型聚丙烯酰胺经不同改性可成为下述三种类型之一；微生物絮凝剂之一；微生物絮凝剂阴离子型阴离子型 聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸阳离子型

12、阳离子型 聚丙烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺盐聚丙烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺盐非离子型非离子型 聚氧化乙烯聚氧化乙烯182.4 使用惰性助滤剂使用惰性助滤剂惰性助滤剂惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。易于过滤。在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂微粒上，在发酵液中加入固体助滤剂，则菌体可吸附于助滤剂

13、微粒上，助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降助滤剂就作为胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼层中，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。使用方法使用方法：在滤布上预涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，：在滤布上预涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，待滤毕后与滤饼一起除去；助滤剂按一定比例混入待滤的悬待滤毕后与滤饼一起除去；助滤剂按一定比例混入待滤的悬浮液中，然后一起进入过滤机，使其形成较松的滤饼，降低浮液中，然后一起进入过滤机，使其形成较松的滤饼，降低其可压缩性，让滤液可顺畅通过。其可压缩性，让滤液可顺畅通过。材料材料：如硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素

14、、未活化的碳、：如硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙或这些材料的混合物。炉渣、重质碳酸钙或这些材料的混合物。192.5 杂蛋白的其它去除方法杂蛋白的其它去除方法 等电点沉淀变性吸附沉淀202.6 高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法加酸 钙离子 草酸 镁离子 三聚磷酸钠 铁离子 黄血盐213 悬浮液分离过程和分类悬浮液分离过程和分类22 3.1过滤法过滤法 (Filtration)过滤过滤是指以某种多孔物质作为介质，在外力是指以某种多孔物质作为介质，在外力(压压力差力差PP)的作用下，流体通过介质的孔道，而使的作用下，流体通过介质的孔道，而使固体颗粒被截留下

15、来，从而实现固体颗粒与流体固体颗粒被截留下来，从而实现固体颗粒与流体分离目的的操作。分离目的的操作。过滤可去除气固体中的固体颗粒，也可去除液过滤可去除气固体中的固体颗粒，也可去除液固体中的固体颗粒。固体中的固体颗粒。对于好的定形的晶体，这是一种最直接的步骤对于好的定形的晶体，这是一种最直接的步骤。23过 滤 filtration过滤介质过滤介质filter medium : 过滤采用的多孔物质；过滤采用的多孔物质； 滤浆滤浆filter pulp : 所处理的悬浮液；所处理的悬浮液； 滤液滤液filtrate : 通过多孔通道的液体；通过多孔通道的液体； 滤饼或滤渣滤饼或滤渣 filter c

16、ake:被截留的固体物质。被截留的固体物质。24工业过滤方式: 深层过滤、滤饼过滤 特点：特点：固体颗粒的沉积发生在较厚的粒状过滤介质内部，过滤介质表面上无颗粒层形成 。特点特点：固体颗粒呈饼层状沉积于过滤介质的上游一侧，形成滤饼层 。适用适用：处理颗粒含量较高的悬浮液（0.1%）适用适用：悬浮液中颗粒尺寸甚小而且含量甚微的场合。(10)的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤机一般不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤。此外，采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。59圆盘真空过滤器圆盘真空

17、过滤器由槽体、过滤圆盘和分配头组成；圆盘直径大，更易实现大型化；60圆盘真空过滤器圆盘真空过滤器61硅藻土过滤机 diatomite filteru硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。u硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它是一种预硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它是一种预涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的一般工艺过程。一般工艺过程

18、。u在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。目前，国内主要用于酒类和饮料过滤目前，国内主要用于酒类和饮料过滤 62硅藻63硅藻土过滤机硅藻土过滤机643.4错流过滤错流过滤又称切向流过滤（又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，在压力推动下，悬浮液悬浮液以高速在管状滤膜的以高速在管状滤膜的内壁

19、内壁作切向流动作切向流动，利用流动的剪切作用将过利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度稳定不变的过滤速度65微滤过程示意图微滤过程示意图, ,料液快速经过薄膜料液快速经过薄膜, ,以减少形成滤饼以减少形成滤饼错流过滤错流过滤Cross-Flow Filtration66错流过滤特点(收率高收率高 （97-98%97-98%）(质量好质量好(减少处理步聚减少处理步聚(染菌罐也能进行处理染菌罐也能进行处理(介质阻力大介质阻力大(不能得到干滤饼不能

20、得到干滤饼(需要大的膜面积需要大的膜面积(目前适用于小分子的分离目前适用于小分子的分离 67The end684 离心分离离心分离对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。离心操作往显得十分有效。离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物

21、细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。69离心分离离心分离优点：优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：缺点：与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。 通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体；而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。浆体；而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。70离心分离离心分离利用惯性离心力和物质的沉降系数或

22、浮力密度的利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的分离、浓缩或提炼操作。不同而进行的分离、浓缩或提炼操作。分类分类离心沉降离心沉降 利用固液两相的密度差，在离心机无孔转鼓利用固液两相的密度差，在离心机无孔转鼓或管子中进行的悬浮液的分离；或管子中进行的悬浮液的分离；离心过滤离心过滤 利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离利用离心力并通过过滤介质，在有孔转鼓离心机中分离悬浮液的操作；心机中分离悬浮液的操作；离心分离和超离心离心分离和超离心 利用不同溶质颗粒在液体中各部分利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。714

23、.1 原理原理u=d2/(18 )(s-) 2rd:粒子直径； s和分别为粒子和流体的密度；：流体粘度；u：粒子的运动速度；CD：阻滞系数；A：粒子在运动方向的投影面积；CDf(Re) Re=du / Re1 CD=24/Re 1Re104 CD=24/Re +3/Re0.5+0.34对于生化溶质，一般满足Re1的要求。 ：流体粘度；u：粒子的运动速度；CD：阻滞系数；A：粒子在运动方向的投影面积；CDf(Re) Re=du / Re1 CD=24/Re 1Re104 CD=24/Re +3/Re0.5+0.34对于生化溶质，一般满足Re1的要求。72离心分离因数离心分离因数 Fr = 2r/g；常速离心机常速离心机Fr 3000，中速离心