生化药物制备：植物细胞的内部工程

1、第五章 植物细胞工程制药植物细胞工程：植物细胞工程： 以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。第一节第一节 基本概念基本概念1 1、植物细胞全能性、植物细胞全能性 在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官分化和再生，成为具有与母体植株相同遗传信息的植株的能力。植物细胞全能性的相对性植物细胞全能性的相对性 不是所有基因型的所有细胞在任何条不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；件下都具有良好的培养反

2、应； 细胞全能性并不意味着任何细胞均可细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。以直接产生植物个体。2、植物组织和器官培养 植物组织和器官培养是指在无菌和人工控制的条件下（培养基、光照、温度等），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。3 3、植物细胞分化、植物细胞分化 高等植物的分化可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。 基因的差异性表达，即为细胞分化；具体表现为内部生理变化和外部形态变化。 细胞分化使细胞功能趋于专门化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是进化的表现,越高级的植物类群,分化水平越高,细胞分工越细,机体代谢水平也越高。4 4、细胞脱分化（、细胞脱分化（

3、dedifferentiation)dedifferentiation) 是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。 细胞脱分化阶段细胞脱分化阶段启动阶段：表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出启动阶段：表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；细胞质丝，液泡蛋白体出现；演变阶段：此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原演变阶段：此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；质体；脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。将开始。 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行

4、的程度一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。5 5、细胞再分化（、细胞再分化（redifferentiation)redifferentiation)： 脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新变成未分化的细胞（胚状体）和组织的过程。 * *分化与脱分化的细胞核组织的过程。分化与脱分化的细胞核组织的过程。 极性：极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。愈伤组织形成胚状体一般有两个途径

5、：1、由体细胞或性细胞，通过脱分化形成胚状体。2、通过愈伤组织直接形成胚状体 黑暗培养下烟草愈伤组织愈伤组织 6 6、植物的无菌培养、植物的无菌培养 植物培养/愈伤组织培养/悬浮培养/器官培养/胚胎培养 愈伤组织愈伤组织(callus)(callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。 7、细胞培养、细胞培养 指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增值及分化的培养实验。其目的是为了得到单细胞无形繁殖系。8、分生组织培养、分生组织培养 又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。 如茎尖分生组织，该组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1

6、mm。9、外植体外植体 用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部分如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。1010、无性繁殖系、无性繁殖系 又叫克隆，植物细胞工程中指使母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。1111、突变体、突变体 经过确认已发生遗传变异或新的培养物至少是通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞，叫做突变体。单细胞无性系：由单细胞形成的无性系单细胞无性系：由单细胞形成的无性系单细胞变异体：从统一组织中分离得到的无性系，但彼此间不同单细胞变异体：从统一组织中分离得到的无性系，但彼此间不同12

7、12、继代培养、继代培养 由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养。连续许多代得培养即为继代培养，又称连续培养。13、次级代谢作用和次级代谢产物、次级代谢作用和次级代谢产物次级代谢作用：次级代谢作用：由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。次级代谢产物特征：次级代谢产物特征：1、有明显的分类学区域界限2、生物合成需要在一定的条件下才能发生3、缺乏明确的生理功能4、是生命活动的多余成分 植物组织培养程序植物组织培养程序1 1、配制半固体培养基、配制半固体培养基2 2、无菌操作切取一些、无菌操作切取一些小块组织小块组织3 3、获得愈伤组织、获得愈伤

8、组织4 4、诱导愈伤组织、诱导愈伤组织5 5、再生新植株出现、再生新植株出现脱分化脱分化通过调节营养物质和植物生长调节剂的适当配比通过调节营养物质和植物生长调节剂的适当配比离体、消毒离体、消毒的植物器官的植物器官、组织或细、组织或细胞胞植物体植物体根、芽根、芽脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养植物组织培养愈伤愈伤组织组织脱分化脱分化胚胚状状体体再分化再分化第二节 植物细胞工程发展简史 19世纪上半叶，Schleiden和Schwann提出了细胞学说。 20世纪20年代初至30年代，在胚胎培养和器官培养领域取得了一些成果。 30年代末至40年代，研究集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系。 4

9、0年代末到50年代，植物组织培养进入崭新阶段。 60年代初，分离出植物的原生质体。 70年代中叶，开发培养基和培养研究方法。 75-85年间，优化细胞生长和次级代谢产物形成产物的研究。第三节 植物细胞的形态及生理特性 一 植物细胞的形态 二 植物细胞的结构特征 三 植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分 四 植物培养细胞的生理特性一、 植物细胞的形态植物细胞的亚显微结构 （质膜）（质膜）洋葱表皮细胞显微结构细胞壁细胞壁细胞核细胞核液泡液泡细胞质细胞质二、 植物细胞的结构特征模式植物细胞构造 细胞壁细胞壁胞间层胞间层初生壁初生壁次生壁次生壁后含物后含物 原生质体原生质体贮藏物质贮藏物质晶晶 体

10、体细胞膜细胞膜细胞质细胞质细胞器细胞器细胞核细胞核模式模式植物植物细胞细胞 模式植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成模式植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成质体质体线粒体线粒体液泡液泡内质网内质网核糖体核糖体高尔基体高尔基体动植物细胞区别细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有三、 植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分1 生理活性物质 A 酶 B 维生素 C 植物激素 D 抗生素和植物杀菌素2 其他成分 A 生物碱 B 糖苷类 C 挥发油 D 有机酸四、 植物培养细胞的生理特性延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快加速期：最大生长期，最大细胞浓度

11、对数期：细胞数呈对数增加稳定期：细胞高液泡化，积累代谢产物，非常脆弱 *悬浮培养的植物细胞很少以单一细胞悬浮状态进行生长，多以非均相集合体的细胞团形式存在。细胞团产生的原因：*细胞没有进行分裂后分离。*细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其他方式形成黏性表面。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清植

12、物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株、制造人病毒植株、制造人工种子工种子获得细胞或细胞分获得细胞或细胞分泌蛋白泌蛋白第四节 植物细胞培养的基本技术 一 植物材料的准备 二 培养基及其组成 三 培养方法最重要的是无菌最重要的是无菌 植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。如果是来自温室或者大田的植物种子、幼苗。器官、组织等，可能带有多种生长迅速的微生物。一、 植物材料的准备植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂 不同器官的灭菌方式不同（表5-6）1 无机盐： 大量元素：N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na 微量元素：Fe, Mn, Zn, Cu

13、, Co, Ni等。2 碳源： 糖类，肌醇等 直接通过光合作用吸收CO2二、培养基及其组成3.植物生长调节物质 植物激素是指植物代谢过程中自身形成的植物生长调节剂。包括生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。（1）生长素类生长素类: :(例）在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程,每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养，通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.51mg/L。 在这样一种培养上,愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团,称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代,胚性细胞团的数量不断增加,但并不出现成熟的胚。然而,如果把胚性

14、细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养上,它们就能发育为成熟的胚。 *另： 吲哚乙酸(2)细胞分裂素类细胞分裂素类: : 既或促进也可抑制体细胞胚的发生,这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用,特别有利于子叶的发育。另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性,如在胡萝卜的研究中发现,虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为0.1M的玉米素却能促进这个过程,而6-BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。 * *植物组织的生长主要取决于生长素和分裂素的比例。植物组织的生长主要取决于生长

15、素和分裂素的比例。4.氮源 植物组织和细胞培养实验中使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物或各种氨基酸。氮源有还原态氮(NH4+)和氧化态氮(NO3-)两种。在以KNO3为唯一氮源(如White培养基)的培养上建立起来的愈伤组织,去掉生长素以后不能形成胚。 5.维生素三、 培养方法按培养基类型分为： 固体培养和液体培养1. 分批培养法2. 半连续培养法3. 连续培养法4. 固定化培养法植物组织培养技术的流程第五节 影响植物次级代谢产物积累的因素 影响植物次级代谢产物生产和积累的主要因素有：生物条件/物理条件/化学条件/工业培养条件一、 外植体选择 不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累

16、积时间各异。二 培养条件的影响1. 内在因素（菌种和营养条件）*接种和诱导*培养基成分磷、氮、铜、碳源、植物生长调节剂、O2和pH2.两步法培养 第一步使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）的培养方法。 3.外在因素（环境条件） 温度，搅拌频率，容器，光照影响影响因子影响因子外因外因内因内因遗传性状遗传性状生理状态生理状态营养条件营养条件环境条件环境条件无机盐无机盐有机物有机物激素激素天然复合物天然复合物渗透压渗透压酸碱度酸碱度湿度湿度温度温度光照光照第六节 植物细胞培养的生物反应器一、植物细胞与微生物细胞的差异 在形态、生理和结构上差异显

17、著二、生物反应器细胞大规模生产的为发酵罐；产生次级代谢产物的装置称为生物反应器三、生物反应器的种类a、摇瓶b、搅拌型生物反应器c、环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器1 、机械搅拌式生物反应器2、 鼓泡塔生物反应器3、 气升式生物反应器4、 转鼓式生物反应器5、 固定化细胞生物反应器四、 各种生物反应器性能比较第七节 进展与展望一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用 诱导子是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应的的因子。诱导子能快速、高度专一性的诱导特定基因的表达。1、诱导子的分类（1）、定义（2）、内源性诱导子（3）、外源性诱导子多糖类糖蛋白类蛋白类不饱和脂肪酸类2、诱导子引起的生理生化反应：膜脂超氧化和膜膜结构功能的改变形成和积累抗微生物的低相对分子质量植保素蛋白酶抑制物的积累合成和分泌降解微生物细胞壁的酶3、诱导子在组织/细胞培养及其次生代谢产物生物合成研究中的应用糖蛋白类诱导子蛋白质类诱导子多糖类诱导子微生物类诱导子 对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素。二、前体饲喂 前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。主要包括3种结构单位的供应：莽草酸/氨基酸/乙酸三、两相法培养 基本出发点基本出发点：在细胞外创造一个次级代谢产物 的贮存单