微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究

1、微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究 郑雪芳 1，刘波1 ，蓝江林1，苏明星1， 卢舒娴 1，朱昌雄2，关雄3 （1、福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003；2、中国农业科学院环境与可可持续 发展研究所，北京 100081；3、福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002） 摘要摘要：【目的】通过调查微生物发酵床养猪基质垫层大肠杆菌及其毒素基因的数量分布变化动态，分析微生物发酵 床对猪舍大肠杆菌的生物防治作用。 【方法】分离不同使用时间、不同层次基质垫层的大肠杆菌，利用 pcr 扩增特 异性 u

2、dia 基因鉴定来检测大肠杆菌，并对大肠杆菌 12 种毒素基因进行多重 pcr 检测。构建大肠杆菌种群分布的 动态模型，分析微生物发酵床对大肠杆菌病原的生防效果。 【结果】从不同使用时间不同层次基质垫层分离鉴定出 大肠杆菌 419 株，并从这些菌株中检测出 59 株携带毒素基因大肠杆菌，毒素基因为 8 种。其中基质垫层的毒素基 因阳性检出率最高在 1 个月，为 22.47%，其次在 7 个月，为 16.5%,检出率最低的在 9 个月，为 4.23%大肠杆菌在微 生物发酵床基质垫层种群数量时间变化规律为：随着使用时间的增加种群数量逐步减少；种群数量空间变化规律为： 表层（第 1 层 010cm）

3、 和底层（第 4 层 6070cm）分布量最大，第 2 层（2030cm）分布量最少。大肠杆菌毒素 基因的分布规律与之类似。从构建的大肠杆菌种群分布动态模型可以看出，基质垫层第 1 层（y=169.67x-1.0137）和第 3 层（y=313.11x-2.1885）大肠杆菌种群数量随使用时间呈指数线性方程分布；第 2 层（y=0.1006x3-2.3733x2+16.094x- 22.454）和第 4 层（y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513）大肠杆菌种群数量随使用时间呈一元三次方程分布，基 质垫层能明显抑制大肠杆菌的生长。基质垫层使用后期（第 9 个月）比

4、使用初期（第 1 个月）大肠杆菌种群数量明 显减少，降低幅度在 67.45%96.53%，说明微生物发酵床对猪舍大肠杆菌能起到显著的生物防治作用。【结论】微 生物发酵床能抑制大肠杆菌特别是携带毒素基因大肠杆菌的生长，且对大肠杆菌的生防效果随使用时间的延长而增 加。 关键词关键词：微生物；发酵床养猪；生物防治；大肠杆菌；毒素基因 study on the biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathogen escherichia coli in the piggery zheng xuefang1, liu b

5、o1*, lan jianglin1,shu mingxing1, lu shuxian1, zhu changxiong2, guan xiong3 (agricultural bio-resources research institute, fujian academy of agricultural sciences, fujian fuzhou 350003; 2. institute of environment and sustainable development in agriculture, chinese academy of agricultural sciences,

6、 beijing 100081; 3. key laboratory of biopesticide and chemical biology, fujian agriculture and forestry university, ministry of education, fuzhou 350002) 基金项目：基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项-华南村镇塘坝地表饮用水安全保障适用技术研究与示范（no.2008zx07425-002） ；福建 省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（no.stif-y03） supported by the national key

7、technology program for water body pollution control and rectification（no.2008zx07425-002） and the financial department of fujian government-science；technology innovation foundation of faas(no.stif-y03) 作者简介作者简介：郑雪芳（1977） ，女，助理研究员,e-mail: ；*通讯作者（责任作者）通讯作者（责任作者） ，e - mail： biography: zheng xuefang(197

8、7), female, assistant professor, e-mail: ; *corresponding author, e - mail： abstract: 【objective】 the present paper dealt with the distribution of escherichia coli and its virulent genes in the stroma cushion of piggery to clear the biocontrol effects of microbial-fermentation bed on the pig pathoge

9、n e. coli.【method】the bacterium, e. coli isolated from the different period in each layer of the stroma cushion were analyzed by the method of eosin methylene blue (emb) medium. polymerase chain reaction (pcr) procedure was applied for identification of e. coli by amplifying udia gene dna fragments

10、of e. coli. multiplexpcr was used to detect the virulence genes types of e. coli. a simulation model of e. coli distribution was constructed to analyze the biocontrol effect in the microbial-fermentation bed.【result】the result showed that 419 isolates were detected to be e. coli among 433 suspected

11、isolates, of which 59 isolates carried the special virulent genes. a total of 8 types of virulent genes were found, including estb, esta, elt, faeg, feda, aidai, stx2e and sepa. in the samples, e. coli in the one-month-used microbial-fermentation bed had the highest positive rate (22.47%), while tha

12、t in the nine-months-used microbial-fermentation bed had the lowest positive rate (4.23%). the distribution rule displayed that the population of e. coli in each layer decreased as the time increased. the less distribution of e. coli population was accrued in the layer 1, while the largest in the la

13、yer 4 as well as the least in the layer 2. the distribution rule of virulent genes for e. coli was the similar to the distribution rule of e.coli population. from the dymamic model of e. coli population, it could be seen that the e. coli populations in the layer 1 (y=169.67x-1.0137) and the layer 3

14、(y=313.11x-2.1885) were fitted to the exponential distributions, as e. coli population in the layer 2 (y=0.1006x3- 2.3733x2+16.094x-22.454) and the layer 4 (y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513) were followed to simple cubic equation. the cushion stroma of piggery could inhibit the growth of e. coli

15、and the amount of e. coli in the nine-months-used stroma cushion was much more less than that in the one-month-used stroma cushion with decreases ranged from 67.45% to 96.53%, indicating that the microbial-fermentation bed could play an important role in biogicontrol of e.coli in the piggery.【conclu

16、sion】the microbial-fermentation bed could restrain the growth of e.coli, especially for the bacteria carried with the virulent genes. the longer the microbial-fermentation bed was used the more biocontrol effect was on the population of e.coli. key words: microbe; microbial-fermentation bed for rari

17、ng pig; biocontrol; escherichia coli; virulence gene 【研究意义】生猪疫病一直是困扰养猪业的一道难题。许多研究13表明，猪舍的不良环境是 许多疾病的诱因，只有给猪提供舒适、干净的生活环境才能减少生猪疫病的发生，提高生猪的生 产能力。微生物发酵床养猪是近年我国引进的一种新兴养猪模式，它给农户和养殖户带来可观经 济效益的同时也减轻了对环境的污染，是一种无污染、无排放、无臭气的环保养猪技术46。应用 微生物发酵床养猪技术，可彻底解决养猪对环境的污染，改善猪舍环境，减少生猪疫病。 【前人研 究进展】许多研究表明1,79，微生物发酵床的基质垫层能形成以

18、有益微生物为优势菌群的生物保 护屏障，阻止有害微生物的侵入，对致病菌的定殖产生抑制作用。有些专家1012则认为微生物发 酵床通过微生物发酵，使垫料里层温度高达 6070，杀灭或抑制细菌、病毒繁殖，从而有利于 生猪健康生长。刘振钦等13调查发现，微生物发酵床养猪与传统养猪相比，猪死亡率下降 96% ， 可能原因是微生物发酵床垫层形成的平衡稳定的微生态区系能抑制有害微生物的生长，有利于保 持猪肠道健康，减少猪的肠道疾病。李荣林等14对发酵床养猪和常规养猪进行对比分析发现，发 酵床养猪出现疾病的情况明显少于常规养猪，且发酵床养猪的各项肉质指标均优于常规养猪。许 多研究已证明微生物发酵床养猪能够降低生

19、猪疫病的发生，但微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原 生物防治作用的相关研究未见报道。 【本研究切入点】 为了阐明微生物发酵床基质垫层对猪肠道 疾病的生防机理，笔者拟以大肠杆菌为靶标菌，调查大肠杆菌特别是致病性大肠杆菌在基质垫层 的分布动态，分析微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原的防治作用。首先，根据大肠杆菌普遍存在 的 udia 基因15,16（-d-半乳糖苷酶基因）设计大肠杆菌的特异检测引物，用于微生物发酵床基质 垫层大肠杆菌的检测。其次，采用多重 pcr 法对大肠杆菌携带的毒素基因进行检测和定型。最后， 建立大肠杆菌在基质垫层分布的动态模型。 【拟解决关键问题】本研究通过分析大肠杆菌及其毒素 基因

20、在不同使用时间、不同层次基质垫层分布的数量和类型，得出其分布规律，旨在为微生物发 酵床规模化养猪场猪疫病爆发做出有效的预测预报，同时也为今后猪舍环境污染及防治提供临床 依据。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料材料 培养基和试剂：大肠杆菌鉴别培养基伊红美蓝（北京陆桥技术有限责任公司） ，dna 聚合酶 （上海生工生物工程技术服务有限公司） ，100bp marker（上海英骏生物技术有限公司） 。参考菌株： 标准菌株 ro8c（estb+esta+elt+faeg） 、b44a（fana） 、f107a（feda） 、pd20c（aidai） 、 p16ma（fasa） 、amr-47c（

21、stx2e)、jg280c（asta+paa+sepa）由加拿大农业部南方研究中心 edward topp 博士惠赠。 1.2 方法方法 1.2.1 微生物发酵床大肠杆菌种群动态调查 猪舍基质垫层取样于按零污染养猪标准操作规程进行垫层配比和相关管理的零污染养猪示范基 地宁德新科农牧发展有限公司。取样方法：选择饲养猪 1 个月、3 个月、5 个月、7 个月和 9 个月 的基质垫层，进行 4 层取样（第 1 层 010cm ，第 2 层 2030cm ，第 3 层 4050cm ，第 4 层 6070cm）。每层取样采用五点取样法，样本充分混合后取小样（10g） ，进行大肠杆菌的分离。 1.2.2

22、 微生物发酵床大肠杆菌的分离与培养 采用伊红美蓝鉴别培养基进行分离。每份样品分别称取 10g，于 90ml 无菌水中进行稀释。按 10-2、10-3、10-4梯度稀释样品，然后各取 200l 稀释液涂布于伊红美蓝鉴别培养基平板上，处理后 倒置于 30暗培养箱培养至长出单菌落。根据大肠杆菌在伊红美蓝鉴别培养基会形成黑色带金属 光泽的菌落形态特征，挑出具有代表性的单菌落，并计数、纯化、保存分离得到的菌株。 1.2.3 微生物发酵床大肠杆菌毒素基因检测 dna 模板的制备：将分离到的疑似大肠杆菌菌株用 lb 平板培养基 37纯培养 24h，挑取单菌 落，均匀悬浮于 50l 超纯水中；100 10mi

23、n 后，迅速冰浴 5min，4 10000r/min 离心 1min，取 上清于-20保存备用。引物设计：针对大肠杆菌的 udia 基因设计 1 对大肠杆菌特异检测引物。引 物序列如下：udia:5-aaaacggcaagaaaaagcag-3；5-acgcgtggttacagtc ttgcg-3。 针对大肠杆菌 12 种毒素基因（estb、esta、elt、faeg、fana、feda、aida i、stx2e、asta、paa、fasa、sepa）设计 12 对毒素基因检测引物1720，引物序列见表 1。由上海英 骏生物技术有限公司合成。将 12 种毒素基因分为 3 组进行 4 重 pcr

24、 反应。 表表 1 12 种毒素基因的引物分组和序列种毒素基因的引物分组和序列 table 1 primers groups and sequences of 12 virulence genes pcr 基因 gene 碱基序列 primer sequence 退火温度/ annealing() 片段/bp fragment size(bp) 阳性对照 positive control 1 for-tgcctatgcatctacacaat55113 ro8c 1 estb rev-ctccagcagtaccatctcta 1 for-caactgaatcacttgactctt55158 ro

25、8c 1 esta rev-aa ata acatccagcacagg 1 for-ggcgttactatcctctctat55272 ro8c 1 elt rev-tggtctcggtcagatatgt 1 for-gaatctgtccgagaatatca55499 ro8c 1 faeg rev-gttggtacaggtcttaatgg 2 for-aatacttgttcagggagaaa59230 b44a 2 fana rev-aactttgtggttaacttcct 2 for-tggtaacgtatcagcaacta59313 f107a 2 feda rev-acttacagtg

26、ctattcgacg 2 for-acagtatcatatggagcca59585 pd20c 2 aida-1 rev-tgtgcgccagaactatta 2 for-aatagtatacggacagcgat59733 amr-47c 2 stx2e rev-tctgacattctggttgacgc 3 for-tcggatgccatcaacacagt62125 jg280c 3 asta rev- gtcgcgagtgacggctttgtaag 3 for-ggcccgcatacagccttg62282 jg280c 3 paa rev-tctggtcaggtcgtcaatactc 3

27、for-gta actccaccgtttgtatc62409 p16ma 3 fasa rev-aagttactgccagtctatgc 3 for-taa aacccgccgcctgagta62611 jg280c 3 sepa rev-tgccggtga acaggaggttt 大肠杆菌的特异检测：总体系为 25l，其中 10pcr buffer 2.5 l，10 mm dntp 0.5l，10m 引物 1l，taq 酶 1 单位，dna 模板 25 ng 。pcr 反应程序：94 预变性 3min；94变性 1min，55 退火 30 sec，72 延伸 1min，重复 35 个循环；最

28、后 72延伸 7 min。大肠杆菌毒素基因检测：采用多重 pcr 法进行大肠杆菌毒素基因检测，分 3 组 4 重 pcr，反 应体系均为 25 l，含 taq 酶 1u，10pcr buffer 2.5 l ，10 mm dntp 0.5l ，10m 引物 1l 和 dna 模板 25 ng。3 组反应的 pcr 程序，组 i 为预变性 15 min（95 ） ；变性 1 min（95 ） ，退 火 1 min（55 ） ，延伸 2 min（72 ） ，重复 30 个循环（每下一个循环退火时间加 3 s） ；最后延伸 10 min（72 ） 。组 ii 为预变性 15 min（95 ） ；变性

29、 1 min（95 ） ，退火 1 min（59 ） ，延伸 2 min（72 ） ，重复 30 个循环（每下一个循环退火时间加 3 s） ；最后延伸 10 min（72 ） 。组 iii： 预变性 15 min（94 ） ；变性 1 min（94 ） ，退火 1 min（62 ） ，延伸 1 min（72 ） ，重复 35 个 循环；最后延伸 10 min（72 ） 。pcr 产物的检测：取 10 l pcr 产物，点样于 1.5%的琼脂糖凝 胶中，以 100 bp marker 作为标准分子量，120 v 电压、1 倍 tae 缓冲液中电泳 2 h，eb 染色，采 用凝胶成像系统观察结果。

30、 2 结果与分析结果与分析 2.1 大肠杆菌毒素基因检测大肠杆菌毒素基因检测 2.1.1 大肠杆菌的特异检测大肠杆菌的特异检测 从不同使用时间、不同层次的基质垫层中分离的 433 株疑似大肠杆菌经大肠杆菌特异检测引物 的鉴定结果如图 1 所示，这对引物在大肠杆菌菌株扩增出大小约 150bp 的条带，在清水对照和不是 大肠杆菌的菌株中没有扩增出相应的片段，说明这对引物对大肠杆菌是特异的，同时，也说明零污 染养猪猪舍基质垫层有大肠杆菌的存在。分离的 433 株疑似大肠杆菌中检测出 419 株为阳性，阳性 率为 96.77%，分别在 1 个月基质垫层分离的 94 株疑似大肠杆菌中检测出 89 株阳性

31、，3 个月基质垫 层分离的 63 株疑似大肠杆菌中检测出 60 株阳性菌株，5 个月基质垫层分离的 96 株疑似大肠杆菌 中经检测全部为阳性菌株，7 个月基质垫层分离的 106 株疑似大肠杆菌中检测出 103 株阳性菌株， 9 个月基质垫层分离的 74 株疑似大肠杆菌中检测出 71 株阳性菌株。 图 1 大肠杆菌特异检测图谱 注：111 为大肠杆菌阳性检测；1215 为大肠杆菌阴性检测；16 为阳性对照；17 为阴性对照；m 为分子量标准 （3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、

32、200bp、10 0bp） fig.1 pattern of pcr specifically amplification with e.coli note：lanes 111：escherichia coli positive by pcr ; lanes 1215 : escherichia coli negative; lane 16 is positive control; lane 17 is negative control; lane m is dna size marker 2.1.2 大肠杆菌毒素基因的检测大肠杆菌毒素基因的检测 （1）大肠杆菌毒素基因检测：利用建立的多重 p

33、cr 对 419 株经鉴定为大肠杆菌的菌株进行毒 素基因检测，结果发现，样品中存在 12 种毒素基因中的 8 种毒素基因，分别是第 1 组毒素基因 estb、esta、faeg、 elt，第 2 组毒素基因 feda、aidai、stx2e 和第 3 组毒素基因 sepa。扩增产物 大小与阳性对照一致（图 2） 。 图 2 大肠杆菌毒素基因 pcr 检测图谱 注：15 为大肠杆菌毒素基因第 1 组检测结果，其中 4 为阳性对照 ro8c，5 为空白对照；611 为大肠杆菌毒素基 因第 2 组检测结果，其中 9 为阳性对照 pd20c，10 为阳性对照 amr-47c，11 为空白对照；1217

34、 为大肠杆菌毒素 基因第 3 组检测结果，其中 15 为阳性对照 p16ma，16 为阳性对照 jg280c，17 为空白对照；m 为分子量标准 （3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1031bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10 0bp） fig.2 pcr electrophoretogram for detection of virulence genes of escherichia coli note: 15 is the result of pcr detection of virulence

35、genes of escherichia coli with primer group, and no.4 is positive control ro8c, no.5 is negative control; 611 is the result of pcr detection of virulence genes of escherichia coli with primer group, and no.9 is positive control pd20c, no.10 is negative control; 1217 is the result of pcr detection of

36、 virulence genes of escherichia coli with primer group, and no.15 is positive control p16ma, no.17 is negative control; m is dna marker(3000bp, 2000bp, 1500bp, 1200bp, 1031bp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp,100bp) （2）大肠杆菌毒素基因数量分布：结果见表 2。从 1 个月基质垫层中分离到的 89 株大肠杆菌 中检测到 20 株含毒素基因

37、，阳性检出率为 22.47%，其中 5 株携带 estb 基因，2 株携带 elt 基因， 6 株携带 faeg 基因，1 株携带 aidai 基因，2 株携带 sepa 基因， 1 株携带 faeg +sepa 2 种毒素基 因的菌株，1 株携带 faeg +stx2e 2 种毒素基因，1 株携带 estb+faeg+elt 3 种毒素基因，1 株携带 estb+esta+feda 3 种毒性因；3 个月基质垫层分离到的 60 株大肠杆菌中检测出 7 株含毒素基因，阳 性检出率为 11.67%，基中 1 株携带 esta 基因，4 株携带 faeg 基因，1 株携带 aidai 基因，1 株

38、 携带 esta+faeg 2 种毒素基因；5 个月基质垫层分离的 96 株大肠杆菌中检测出 13 株含毒素基因， 阳性检出率为 13.54%；其中 1 株携带 esta 基因，1 株携带 faeg 基因，2 株携带 feda 基因、2 株携 带 stx2e、2 株携带 aidai 基因，2 株携带 stx2e+aidai 2 种毒素基因，3 株携带 feda+stx2e+aidai 3 种毒素基因；7 个月基质垫层分离的 103 株大肠杆菌中检测出 14 株含毒素基因，阳性检出率为 13.59%；其中 1 株携带 estb 毒素基因，4 株携带 faeg 基因，2 株携带 elt 基因，4

39、株携带 aidai 基 因，1 株携带 elt+faeg 2 种基因，1 株携带 esta+ faeg 2 种基因，1 株携带 estb+esta+ faeg 3 种毒素 基因；9 个月基质垫层分离的 71 株大肠杆菌中检测出 3 株含有毒素基因，阳性检出率为 4.23%。其 中 1 株携带 feda 基因、1 株携带 elt 基因，1 株携带 stx2e+aidai 2 种毒素基因。 表 2 不同使用时间基质垫层大肠杆菌毒素基因的检测结果 table 2 result of escherichia coli virulence genes detection from different u

40、sing time stroma cushion 使用时间 using time 检测数量 amount of detection 毒素基因类型 types of virulence gene 毒素基因检出量 quantities of virulence genes 毒素基因检出率 raitio of virulence genes（%） estb55.62 elt22.25 faeg66.74 aidai11.12 sepa22.25 faeg +sepa 22.25 faeg +stx2e11.12 estb+faeg+elt11.12 1 个月 基质垫层 one month strom

41、a cushion 89 estb+esta+feda11.12 esta11.67 faeg46.67 aidai11.67 3 个月基质垫层 three months stroma cushion 60 esta+faeg11.67 esta11.04 faeg11.04 feda22.08 stx2e22.08 aidai22.08 stx2e+aidai22.08 5 个月基质垫层 five months stroma cushion 96 feda+stx2e+aidai33.13 estb10.977 个月基质垫层 nine months stroma 103 faeg43.88

42、elt21.89 aidai43.88 elt+faeg10.97 esta+ faeg10.97 cushion etb+esta+ faeg10.97 feda11.41 elt11.41 9 个月基质垫层 nine months stroma cushion 71 stx2e+aidai11.41 （3）大肠杆菌毒素基因特征分布：从不同使用时间、不同层次基质垫料分离的携带毒素基因 的大肠杆菌菌株中分析，只携带单一的毒素基因菌株占 74.14%，同时携带两种毒素基因的菌株占 15.52%，同时携带 3 种毒素基因的菌株占 10.34%。毒素基因 aida-1 在不同使用时间的基垫料中均 有

43、分布，而毒素基因 faeg 和 esta 只在基质垫料使用的前期分布，在基质垫料使用的后期（9 个月 开始）并没分布。毒素基因 faeg、estb 和 feda 在不同层次的基质垫料中均有分布，而毒素基因 elt、esta、aida-1、stx2e 和 sepa 只分布在基质垫料的第 1、3、4 层，在基质垫料的第 2 层没有分布。 2.2 微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群毒素基因分布动态微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群毒素基因分布动态 （1）大肠杆菌种群毒素基因时间分布动态：不同使用时间的基质垫层大肠杆菌毒素基因类型 和分布数量存在较大差异（表 3） 。1 个月新鲜垫层分布的毒素基因种类和数

44、量最多，毒素基因分布 总量为 2.08105 cfu/mlg；9 个月基质垫层大肠杆菌毒素基因分布数量最低，毒素基因分布总量为 5.0104 cfu/mlg。1 个月新鲜垫层分布 12 种毒素基因中的 8 种毒素基因，分别是 faeg、elt、esta、estb、feda、aida-1、stx2e 和 sepa，其中 sepa 基因（耐药性因子）分布量最大， 为 7.0104 cfu/mlg，stx2e 基因（志贺氏毒素）分布量最低，为 1.0103 cfu/mlg；3 个月基质垫层 分布 3 种毒素基因，分别是 faeg、esta 和 aida-1；5 个月基质垫层分布 5 种毒素基因，分别

45、是 faeg、esta、feda、aida-1 和 stx2e，其中 feda 基因（菌毛 a 亚单位基因）分布量最大，为 5.9104 cfu/mlg，faeg 基因（菌毛蛋白基因）分布量最低，为 1.0103 cfu/mlg；7 个月基质垫层分布 6 种 毒素基因，分别是 faeg、elt、esta、estb、feda 和 aida-1，其中 faeg 基因分布量最大，为 1.0105 cfu/mlg，feda 基因分布量最低，为 1.0103 cfu/mlg；9 个月基质垫层分布 4 种毒素基因，分别是 elt、feda、aida-1 和 stx2e，feda 分布量为 2.0104 c

46、fu/mlg，elt、aida-1 和 stx2e 分布量为 1.0104 cfu/mlg。随着垫料使用时间的延长，毒素基因在基质垫层中的分布渐少，说明基质垫层的使用能 抑制以大肠杆菌为靶标菌的病原菌的生长。 表 3 大肠杆菌不同毒素基因类型时间分布特征（cfu/mlg） table 3 quantities of escherichia coli virulence gene in the stroma cushion of non-pollution pigsty 毒素基因类型 types of virulence gene（103）基质垫层使用时间 using time of strom

47、a cushionfaegeltestaestbfedaaida-1stx2esepa 1 个月基质垫层 one month stroma cushion 35.030.011.049.02.010.01.070.0 3 个月基质垫层 three months stroma cushion 71.00.040.00.00.040.00.00.0 5 个月基质垫层 five months stroma cushion 1.00.020.00.059.016.03.40.0 7 个月基质垫层 nine months stroma cushion 1.060.010.05.04.070.00.00.

48、0 9 个月基质垫层 nine months stroma cushion 0.010.00.00.020.010.010.00.0 （2）大肠杆菌种群毒素基因空间分布动态：大肠杆菌毒素基因在微生物发酵床基质垫层的空 间分布动态如表 4 所示，各毒素基因基本上都是在第 1 层分布量最大，在第 2 层分布量最低。 faeg、estb 和 feda 3 种毒素基因在基质垫层各层次均有分布；elt、stx2e 和 sepa 3 种毒素基因毒素 基因分布规律相同，只分布在基质垫层的第 1、3 和 4 层，且第 1 层分布量最大，其次是第 3 层， 第 2 层没有分布；esta 毒素基因 和 aida-

49、1 毒素基因分布规律相同，都只分布在第 1、3、4 层，且 第 3 层分布量最大，其次是第 1 层，第 2 层没有分布。 表 4 大肠杆菌不同毒素基因类型在基质垫层空间分布特征（cfu/mlg） table 3 quantities of escherichia coli virulence gene in the stroma cushion of non-pollution pigsty 毒素基因类型 types of virulence gene（103）基质垫层使用时间 using time of stroma cushionfaegeltestaestbfedaaida-1stx2e

50、sepa layer 1150.060.026.05.023.050.033.030.0 layer 230.00.00.02.033.00.00.00.0 layer 3100.030.045.027.017.070.011.020.0 layer 410.010.010.020.012.026.01.120.0 2.3 微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群空间分布动态微生物发酵床养猪垫层大肠杆菌种群空间分布动态 不同使用时间、不同层次的基质垫层大肠杆菌的分布见图 2，从基质垫层的不同使用时间来看， 随着使用时间的增加，基质垫层大肠杆菌分布量减少，这可能是因为基质垫层使用一段时间后，垫 层 c

51、源和 n 源等微生物生长的必须营养成分含量降低，从而限制微生物的生长包括大肠杆菌的生 长；从基质垫层的不同层次来看，基质垫层的表层（layer1）大肠杆菌分布量最多，其次是底层 （layer4） ，基质垫层的第二层（layer2 离表层 3040cm）分布量最少，大肠杆菌在基质垫层的这 种分布规律与大肠杆菌的生长条件相关。大肠杆菌属兼性厌氧菌，适宜生长温度为 15-46，最适 生长温度为 37。基质垫层表层通气量好，且温度（25-35）适宜，故大肠杆菌在基质垫层的表 层分布量最大；基质垫层底层虽通气量差，但为大肠杆菌的生长营造了厌氧环境，且温度适宜，所 以也分布量较大；基质垫层的第二层温度高达

52、 55-65，不适大肠杆菌生长，故大肠杆菌在基质垫 层的第二层分布量最少。 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 layer1 layer2 layer3 layer4 大肠杆菌的分布数量（104） cfu/mlg amount of escherichia coli distribution in stroma cushion 图 2 零污染养猪猪

53、舍基质垫层大肠杆菌的分布动态 fig.2 distribution of escherichia coli in the stoma cushion of non-pollution pigsty 1 month litter system 3months litter system 5 months litter system 7 months litter system 9months litter system 2.4 微生物发酵床对猪舍大肠杆菌生物防治的效果微生物发酵床对猪舍大肠杆菌生物防治的效果 以基质垫层使用时间为“x”变量，以大肠杆菌在基质垫层不同层次的分布数量为“y”变量，构建

54、 大肠杆菌在不同使用时间、不同层次基质垫层的分布动态的回归模型。从图 3 可以看出，基质垫层 表层（第 1 层）大肠杆菌种群数量从刚开始使用第 1 个月的 4.67105 cfu/mlg 下降至使用第 9 个月 的 1.52105 cfu/mlg，下降幅度为 67.45%，基质垫层表层大肠杆菌种群数量随使用时间变化符合 方程 y=169.67x-1.0137（r2=0.8461）；基质垫层第 2 层大肠杆菌种群数量随使用时间呈现先上升后下 降的趋势，峰值出现在使用第 3 个月的基质垫层，符合方程 y=0.1006x3-2.3733x2+16.094x-22.454 （r2=0.7692）；基质

55、垫层第 3 层大肠杆菌分布数量随使用时间变化与第 1 层相似，符合指数线性 方程 y=313.11x-2.1885（r2=0.7421），大肠杆菌种群数量从使用第 1 个月的 1.93105 cfu/mlg 下降至 使用第 9 个月的 6.70103 cfu/mlg，下降幅度为 96.53%；基质垫层最底层（第 4 层）大肠杆菌分 布数量随使用时间呈先降后升再降的变化趋势，大肠杆菌分布数量最大值出现在使用 7 个月的基质 垫层，分布量为 2.42105 cfu/mlg，基质垫层底层大肠杆菌种群数量随使用时间的的变化符合方程 y=0.3159 x3+6.0913x2-35.634x+79.513

56、（r2=0.90）。总体上，大肠杆菌在基质垫层不同层次的分布 数量都比猪粪便直接分离的大肠杆菌少 10000 倍，且随着垫层的使用，基质垫层形成平衡稳定的微 生态体系，对大肠杆菌生物防治效果更为明显。 y = 169.67x-1.0137 r2 = 0.8461 0 10 20 30 40 50 60 13579 使用时间（月）using period(months) 大肠杆菌分布数量（104） cfu/mlg distribution of e.coli y = 0.1006x3 - 2.3733x2 + 16.094x- 22.454 r2 = 0.7692 0 2 4 6 8 10 12

57、 14 13579 使用时间（月）using period(months) 大肠杆菌分布数量（104） cfu/mlg distribution of e.coli 大肠杆菌在不同使用时间基质垫层第 1 层的分布动态 distribution pattern of escherichia coli from stroma cushion of layer 1 in different using period 大肠杆菌在不同使用时间基质垫层第 2 层的分布动态 distribution pattern of escherichia coli from stroma cushion of lay

58、er 2 in different using period y = 313.11x-2.1885 r2 = 0.7421 0 10 20 30 40 13579 使用时间（月）using period(months) 大肠杆菌分布数量（104） cfu/mlg distribution of e.coli y = -0.3159x3 + 4.1957x2 - 15.06x+ 30.082 r2 = 0.9 0 5 10 15 20 25 30 13579 使用时间（月）using period(months) 大肠杆菌分布数量（104） cfu/mlg distribution of e.c

59、oli 大肠杆菌在不同使用时间基质垫层第 3 层的分布动态 distribution pattern of escherichia coli from stroma cushion of layer 3 in different using period 大肠杆菌在不同使用时间基质垫层第 4 层的分布动态 distribution pattern of escherichia coli from stroma cushion of layer 4 in different using period 图 3 大肠杆菌在不同使用时间、不同层次基质垫层分布的动态模型 fig.3 distributi

60、on pattern of escherichia coli from different layers of stroma cushion in different using period 3 讨论讨论 3.1 微生物发酵床大肠杆菌毒素基因检测及其分布动态 病原性大肠杆菌是一种常见的人畜胃肠疾病的病原微生物，使人畜发生腹泻、水肿病，甚至死 亡2123。大肠杆菌毒力主要取决于是否携带相应的毒素，如志贺氏毒素（stx2e）和扩散性黏附素 （aidai）这两个毒素基因所编码的毒素是大肠杆菌o157h7高危菌株的主要致病因子24，引起仔 猪水仲病。肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic e