第四章 酶分离纯化

1、Chapter 4 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的提取、分离和纯化酶的提取、分离和纯化Contents of chapter 4第一节 酶的提取与分离纯化技术路线第二节 细胞破碎第三节 酶的提取第四节 酶的分离方法GoGoGoGo第五节 酶的浓缩、干燥与结晶Go第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价Go第一节第一节 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过

2、滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crude protein): 取样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各种 柱层析法。(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。酶分离纯化不同阶段酶分离纯化不同阶段第二节 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进

3、行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通

4、过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破结构受到破坏，而达到细胞破碎碎细胞破碎方法及其原理利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。破碎。用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞，用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞，也可以用于微生物，特别是细菌细胞的破碎。也可以用于微生物，特别是细菌细胞的破碎。利用研钵、石磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将利用

5、研钵、石磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。可以加入精制石英砂、小玻璃球、氧组织细胞破碎。可以加入精制石英砂、小玻璃球、氧化铝等作为助磨剂。化铝等作为助磨剂。常用于微生物和植物组织细胞的破碎。常用于微生物和植物组织细胞的破碎。细胞细胞 声波声波 机械机械 渗透压渗透压 冻融冻融动植物动植物 + + + + + + +革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 + + + + + + +革兰氏阳性芽孢菌革兰氏阳性芽孢菌 + + + + + + +酵母酵母 + + + + + + +革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌 + - + + - + +菌丝菌丝 - + - +- + - +孢子孢子 - - - -l有

6、机溶剂有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。l表面活性剂表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎

7、效果较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。细胞破碎确认细胞破碎确认 1.1.直接测定破碎前后的细胞数：直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.2.测定导电率：测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.3.测定释放的蛋白质

8、量或酶活力：测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。碎率。 l酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。l酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等等进行提取进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。

9、第三节第三节 酶的提取酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。采用低温下（0-10）操作。一、酶的主要提取方法一、酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些

10、与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶l盐溶: 当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。l盐析:当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子，相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。 二、影响提取的主要因素二、影响提取的主要因素1、温度 提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散提高温

11、度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，这容易引起酶的变形。在不影响酶的速度，但是温度过高，这容易引起酶的变形。在不影响酶的活性的条件下适当提高温度，有利于酶的提取。活性的条件下适当提高温度，有利于酶的提取。2、Ph 在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PHPH不宜过高不宜过高或过低，以免引起酶的变形失活或过低，以免

12、引起酶的变形失活。3、提取液体积 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总用量为原料体积的总用量为原料体积的3-53-5倍。倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小颗粒体积越小则则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅适当的搅拌拌可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面，可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速度；适当度；适当延长提取时间延长提取时间，可以使更多的酶溶解出，可以使更多的酶溶解出

13、来。来。第四节 酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低溶解度降低，而，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液通过在酶液中添加一定

14、浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的这一特性，通过调节溶液的pHpH值，值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶一定量的某种有机溶剂，使酶或

15、杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离与杂质分离复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物与酶形成复合物而沉淀下来，而沉淀下来，从而使酶与杂质分离从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀杂质变性沉淀，而不，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离影响所需的酶，从而使酶与杂质分离1.1 盐析盐析 KsKs分段盐析分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（为常数），利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值)使不同的酶或蛋白质分离的方法。Ks：代表盐析效率 。其含

16、义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。 ：表示温度一定时，离子强度为0时某一蛋白质的溶解度.分段盐析分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下（I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。 通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以以硫酸铵最为常用硫酸铵最为常用。 硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。 有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引的介电常

17、数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等，常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等，丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2 2倍左右，终浓度为倍左右，终浓度为70%70%。介电常数介电常数: :介质在外加电场时会产生感应电荷而削弱电场，原外加电场介质在外加电场时会

18、产生感应电荷而削弱电场，原外加电场( (真空中真空中) )与最终与最终介质中电场比值介质中电场比值. .1.2 1.2 有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数）优缺点：优缺点： 优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白质变性失活 2)2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 影响因素：影响因素：（1 1）温度）温度 ：低温（低温（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：尽可能靠近其等电点。

19、尽可能靠近其等电点。 （3 3）离子强度：）离子强度：采用采用 0.05mol/L0.05mol/L的稀盐溶液的稀盐溶液 增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 目的目的 防止蛋白质变性防止蛋白质变性 （4 4）蛋白质浓度：）蛋白质浓度：适当，一般为适当，一般为5 52020mg/ml mg/ml 2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。相对离心力相对离心力以往离心机的转速常以每分钟多少转表示，

20、现在常用相对离心力（RCF）表示。两者互换公式如下：RCF=1.2RCF=1.21010-5-5R RN N2 2N表示转速，单位为转/分(r/min);R表示离心半径，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）；RCF表示相对离心力，单位用重力加速度g（g9.8m/s）常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 2.12.1离心机的选离心机的选择择常速离心机常速离心机高速离心机高速离心机超速离心

21、机超速离心机高速离心机：高速离心机：最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置, ,谓谓之高速冷冻离心机。之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机：最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l

22、强度：和离心强度：和离心速度相配速度相配l大小：和转子大小：和转子配套配套l高速超速管要高速超速管要加盖加盖2.2 2.2 常用离心方法常用离心方法 差速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心（1）差速离心）差速离心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法不同的颗粒分批分离的方法。特点：特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。用于分离大小和

23、密度差异较大的颗粒。 优点：优点：操作简单操作简单 。缺点：缺点：1）分离效果较差，分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。 2）贴壁严重。）贴壁严重。 3 3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压。 差速离心分离示意图差速离心分离示意图 （a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 （2）密度梯度离心）密度梯度离心 （density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation） 样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉

24、降系数比较中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液蔗糖溶液。 特点：特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。 步骤：步骤： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加样加样 C.离心离心 D.收集样品收集样品Density gradient ultracentrifugation（3） 等密度梯度离心等密度梯度离心 又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心 （sedim

25、entation equilibrium sedimentation equilibrium centrifugationcentrifugation）。）。 根据颗粒的密度不同而进行分离。根据颗粒的密度不同而进行分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。动，形成区带。 常用常用氯化铯（氯化铯（CsClCsCl）作为梯度介质。作为梯度介质。特点：特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。介质的密度梯

26、度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。l根据颗粒间存在密度差异，在梯度液中进行离心分离时颗粒到达各自等密度区域后就不再移动了，形成一层层颗粒区带。l等密度梯度分为自成形梯度与预成形梯度。l自成形梯度是将梯度介质与样品混在一起，通过离心，介质形成密度梯度，样品颗粒分布在各自不同等密度位置上。l预成形梯度是预先将梯度液按下重上轻铺置于离心管内。它又分线性梯度与阶梯梯度。线性梯度由梯度仪制备或阶梯梯度经过扩散作用而形成，阶梯梯度多用手工铺置而成。 等密度梯度离心示意图等密度梯度离心示意图 （a a）离心前；）离心前； （b b

27、）离心后）离心后 密度梯度离心密度梯度离心等密度梯度离心等密度梯度离心梯度梯度介质介质通常用通常用蔗糖蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度密度密度最大的沉降样品最大的沉降样品离心离心条件条件在最前的沉降物质达在最前的沉降物质达到管底前停止，到管底前停止，短时短时间，低速度间，低速度使各组分沉降到其平衡使各组分沉降到其平衡的密度区，的密度区，长时间，高长时间，高速度速度分离分离依据依据密度相近，但密度相近，但沉降系沉降系数不同数不同沉降系数相近，但沉降系数相近，但密度密度不同不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点总结总结：等密度梯度离心等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密

28、度的静力是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。离物的密度范围。差速离心差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。于各分离物的离心力。密度梯度离心密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。于制备优质的密度梯度溶液。3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜

29、过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 膜分离膜分离 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。 薄膜主要是由薄膜主要是由丙烯腈丙烯腈、醋酸纤维素醋酸纤维素、赛璐玢赛璐玢以及以及尼尼龙龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。物膜等。膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散

30、膜分离扩散膜分离 透析透析3.1 3.1 加压膜过滤的分类及其特性加压膜过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2m 2m酵母、霉菌、动物细酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形胞、植物细胞、固形物等物等滤纸、滤布、纤滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧维多孔陶瓷、烧结金属等结金属等微滤微滤0.20.22m2m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶微滤膜、微孔陶瓷瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超滤膜超滤膜反渗透反渗透

31、20 20生物小分子、盐、离生物小分子、盐、离子子反渗透膜反渗透膜微滤微滤( (MicrofiltrationMicrofiltration，MF)MF) 一种静态过滤，随过一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞直至微孔全被堵塞无 流 动 操 作渗 透 液原 料 液超超 滤滤 (ultrafiltrationultrafiltration，UFUF ) 一种动态过程，由泵提一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面个分

32、力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲的切向力，把膜面截流物冲掉。掉。在蛋白质溶液除盐、浓在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应缩及分离纯化中有广泛的应用。用。 常规过滤常规过滤(A)(A)和超滤和超滤(B)(B)的示意图的示意图 A AB反渗透反渗透（Reverse osmosisReverse osmosis，RORO） 半 透 膜图 1 4 - 3 利用反渗透膜选择利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂性地只能透过溶剂( (通通常是水常是水) )的性质，的性质，对溶对溶液施加压力液施加压

33、力，使溶剂通，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。分离出来的过程。渗透与反渗渗透与反渗透透Reverse Osmosis (RO)Nanofiltration (NF)Ultrafiltration (UF)Microfiltration (MF)3.2 扩散膜分离扩散膜分离- 透析透析（dialysis）溶质分子溶质分子Y Y 从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动蛋白质透析蛋白质透析透析方法及装置透析方法及装置 透析袋透析简单装置。透析袋透析简单装置。A:A:透析夹，透析夹，B:B:透析，透析，C:C:透析示意图透析示意图 3.3

34、电场膜分离电场膜分离（1）电渗析：）电渗析：在外加直流电场的作用下，利用膜的选择透在外加直流电场的作用下，利用膜的选择透过性，使离子从一部分水中迁移到另一部分水中的物理化学过过性，使离子从一部分水中迁移到另一部分水中的物理化学过程。程。 电渗析半透膜（2 2）离子交换膜电渗析）离子交换膜电渗析： 用离子交换膜代替一般的半用离子交换膜代替一般的半透膜。透膜。 应用：应用：脱盐，海水淡化，纯水制脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。氨酸及凝胶电洗脱。4、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性

35、质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。色谱起源色谱起源色谱色谱组分色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和图谱（）和图谱（graphsgraphs）组成色谱一词（）组成色谱一词（Chromatography) Chromatography) 。层析分离方法层析分离方法 层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层离子交

36、换层析析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离混合物中各组分的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，

37、装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 4.1 4.1 吸附层析吸附层析4.2 4.2 分配层析分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。而使各组分分离的方法。分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数。比值。在层析条件确定后，分

38、配系数是一常数。 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为为流动相流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析纸上层析分配薄层层析分配薄层层析分配

39、气相层析分配气相层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 4.3 4.3 离子交换层析离子交换层析凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层

40、析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。4.4 4.4 凝胶层析凝胶层析凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总

41、和（ml）Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰. K. Kd d=0=0时时, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。最先流出。. K. Kd d=1=1时时, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。隙，最后流出。. . 其它组分其它组分0K0Kd d1, 50 ） 2.2.酶的浓度酶的浓度 （恰到好处）（恰到好处） 浓度越高越易结晶浓度越高越易结晶

42、，控制在饱和区以上，控制在饱和区以上，过饱和区以下的过饱和区以下的介稳区介稳区内。内。3. 结晶温度结晶温度 4. 溶液溶液pH5.5.离子强度离子强度 6. 晶核晶核 7.7.结晶时间结晶时间（二）结晶的方法（二）结晶的方法 1. 除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体到过饱和状态而析出晶体 ; 2. 不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。如中性盐、有机溶剂等。 盐析法盐析法 如，前述的如，前述的 有机溶剂法有机溶剂法 均可用于结晶均可用于结晶 等电点等电点 常用的结晶方法：透析平衡结晶法

43、常用的结晶方法：透析平衡结晶法 将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。析出结晶的过程。前提前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要达到一定纯度（经过纯化）。 酶液要浓缩到一定浓度。酶液要浓缩到一定浓度。ResolutionResolution（分辨率）（分辨率）SpeedSpeed（速度）（速度）CapacityCapacity（容量）（容量）RecoveryRecovery（回收（回收率）率）一、一、 设计分离纯化工艺的基本要求设计分离纯化工艺的基本要求第六节 纯化方

44、案的设计与评价二、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2. 根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤3. 根据分子电荷性质的不同： 离子交换层析，电泳4. 根据专一性结合的方法：亲和层析5. 其它：吸附层析，疏水层析（二）纯化方法的排序（二）纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。需样品少的方法，宜后选用。 三、纯化方案的评价三、纯化方案的评价（一）酶活力测定：（一）酶活力测定： 酶活力酶活力(enzyme ac

45、tivity)又称酶活性，是又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。应速率来表示。 一般用单位时间内产物生成的量来表示一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率酶催化的反应速率 。 方法：方法： 在酶反应开始后不同时间，从反在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。得单位时间的酶促反应变化量。 常用的方法常用的方法 ： 1. 化学分析法化学分析法（比色法）：产物可与特定（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 2. 分光光度法分光光度法： 利用底物和产物光吸收性利用底物和产物光吸收性质的不同质的不同 。 3. 量气法量气法： 酶促反应中产物或底物之一为酶促反应中产物或底物之一为气体。气体。 4. 滴定法（滴定法（pH值测量法值测量法）：产物之一是自）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。电极测。 常