生物化学与分子生物学：基因诊断-1-8

1、Institute of Genetic Engineering 基因诊断 Institute of Genetic Engineering 生物化学检查生物化学检查 Institute of Genetic Engineering 安吉丽娜安吉丽娜朱莉（朱莉（Angelina Jolie） Angelina Jolie：My medical choice Institute of Genetic Engineering 安吉丽娜安吉丽娜朱莉乳腺癌发病率已经从朱莉乳腺癌发病率已经从87%87%降至降至5%5%以下以下。 BRCA1 Institute of Genetic Engineerin

2、g 基因多态性：基因多态性： 表型差异性表型差异性 疾病易感性疾病易感性 药物敏感性药物敏感性 Institute of Genetic Engineering 点突变、缺失、插入点突变、缺失、插入 易位、重排、扩增易位、重排、扩增 等等 Institute of Genetic Engineering 1 1、单基因病、单基因病：血友病、地中海贫血：血友病、地中海贫血 2 2、多基因病、多基因病：恶性肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、：恶性肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、 糖尿病；多个基因的累积效应加上环境因素致病糖尿病；多个基因的累积效应加上环境因素致病 3 3、获得性基因病、获得性基因病：外源性基

3、因（如各种微生物感染）：外源性基因（如各种微生物感染） 侵入侵入 Institute of Genetic Engineering 个体化医疗个体化医疗 疾病风险预测（基因检测）疾病风险预测（基因检测） 个体化治疗（基因检测）个体化治疗（基因检测） 优点优点 最有效的医疗最有效的医疗 最经济的医疗最经济的医疗 Institute of Genetic Engineering 概念概念 基本原理基本原理 特点特点 临床意义临床意义 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Gene

4、tic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 类类 型型 疾病名称疾病名称 易感、或致病基因易感、或致病基因 可选择的预防、治疗措施可选择的预防、治疗措施 晚发型遗晚发型遗 甲状腺髓质瘤甲状腺髓质瘤 RET 预防性手术切除预防性手术切除 传病传病 成人型多囊肾成人型多囊肾 多囊肾基因多囊肾基因 预防性手术切除、其他治预防性手术切除、其他治 疗疗 遗传病易遗传病易 肝血色素病肝血色素病 HFE 预防性换血治疗预防性换血治疗 感基因携感基因携 静脉血栓性梗静脉血栓性梗 凝血因子凝血

5、因子 避免吸烟、口服避孕药避免吸烟、口服避孕药 带者带者 塞塞 基因基因(R506Q) 遗传性癌遗传性癌 遗传性乳腺癌遗传性乳腺癌 BRCA1、BRCA2 监测、预防性手术切除监测、预防性手术切除 症易感基症易感基 遗传性非息肉遗传性非息肉 MLH1、MSH2 因因 肠癌肠癌(HNPCC) Institute of Genetic Engineering BRCA1 (breast cancer 1, early onset) 乳腺癌1号基因(BRCA1)，一种直接与遗传性乳腺癌有关的抑抑 癌基因癌基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、 细胞的正常生长、细胞凋亡等方面发挥重要作用

6、。 Institute of Genetic Engineering BRCA1BRCA1、BRCA2BRCA2基因突变与癌症基因突变与癌症 通过对有乳腺癌家族史妇女的通过对有乳腺癌家族史妇女的BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变基因突变 的检测显示的检测显示, ,此类人群中约有此类人群中约有10%10%为为BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因基因 突变的携带者。突变的携带者。BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变的携带者到基因突变的携带者到7070 岁时岁时, ,发生乳腺癌的风险累计达到发生乳腺癌的风险累计达到80%-85% ,80%-85% ,一生

7、中发生乳一生中发生乳 腺癌的风险可高达腺癌的风险可高达90%90% BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变的检测是对于有乳腺癌家族史基因突变的检测是对于有乳腺癌家族史 人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法。人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法。 Institute of Genetic Engineering BRCA1、BRCA2基因突变属于常染色体显性遗传基因突变属于常染色体显性遗传” Institute of Genetic Engineering What can YOU do?What can YOU do? 1.有家族史 2.肿瘤标记物 Institute of

8、Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 探针探针：一段能与待测核酸片段互补结合、经过一段能与待测核酸片段互补结合、经过 特殊标记的特异核苷酸序列。特殊标记的特异核苷酸序列。 制备探针的方法：基因文库法、逆转录法、人制备探针的方法：基因文库法、逆转录法、人 工合成法等工合成法等 通常为通常为已知序列的单链核苷酸片段已知序列的单链核苷酸片段 探针一般探针一般带有标记物带有标记物 Institute of

9、 Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 待测核酸制备待测核酸制备 滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化 杂杂 交交 去除未参与杂交的探针去除未参与杂交的探针 检测杂交信号检测杂交信号 制备探针核酸片段制备探针核酸片段 探探 针针 标标 记记 加入标记核酸探针加入标记核酸探针 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Edwin Mellor Southern 基本程序：基本程序： 1 1、电泳分离、电泳分离DNADNA片段片段 2 2、DNADN

10、A的转膜的转膜 3 3、DNADNA与探针杂交与探针杂交 4 4、检测杂交信号、检测杂交信号 DNADNA印迹（印迹（Southern blottingSouthern blotting） Institute of Genetic Engineering 原位杂交可检出被检基因的空间位置状况，原位杂交可检出被检基因的空间位置状况， 即细胞的具体定位、数目及类型。即细胞的具体定位、数目及类型。 Institute of Genetic Engineering (二二) PCR（聚合酶链式反应（聚合酶链式反应 ） Institute of Genetic Engineering Institute

11、 of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Allele-specific oligonucleotide， ASO 当当基因的突变部

12、位和性质已完全明了基因的突变部位和性质已完全明了时，人工合成两条寡时，人工合成两条寡 核苷酸探针，其中一条与正常基因序列完全一致，能与之核苷酸探针，其中一条与正常基因序列完全一致，能与之 稳定地杂交（稳定地杂交（N），但不能与突变基因序列杂交；另一条），但不能与突变基因序列杂交；另一条 与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不 能与正常基因序列稳定杂交（能与正常基因序列稳定杂交（M)，这样，就可以把只有，这样，就可以把只有一一 个碱基个碱基发生了突变的基因区别开来发生了突变的基因区别开来. PCR/ASO 等位基因特异寡核苷酸（等位基

13、因特异寡核苷酸（ASO)探针杂交探针杂交 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 正常人正常人纯合突变纯合突变 杂合突变杂合突变 PCR/SSCP分析分析 + Institute of Genetic Engineering PCR/ Sequencing Institute of Genetic Engineering 单核苷酸多态性单核苷酸多态性( (single nucleotide polymorphism， SNP),主要是指在基因组水平上主要是指在基因组水平上 由单个核苷酸的变异所引起的由单

14、个核苷酸的变异所引起的 DNADNA序列多态性。序列多态性。 Institute of Genetic Engineering （1）限制性酶切图谱直接分析法）限制性酶切图谱直接分析法 PCR/RFLP （2）RFLP间接分析法间接分析法 PCR/RFLP连锁分析法连锁分析法 Institute of Genetic Engineering 原理：原理：某些疾病的发生是由于基因内单一碱基某些疾病的发生是由于基因内单一碱基 的改变引起，当此突变正好发生在限制性内切的改变引起，当此突变正好发生在限制性内切 酶识别位点时，会导致内切酶图谱的改变，根酶识别位点时，会导致内切酶图谱的改变，根 据这一改变

15、，综合其它因素，可对疾病的发生据这一改变，综合其它因素，可对疾病的发生 诊断。诊断。 MST II识别位点：识别位点： CCTNAGG 正常正常 -珠蛋白基因：珠蛋白基因： 5CCTGAGG3 镰刀型贫血镰刀型贫血 ： 5CCTGTGG3 实例分析实例分析： 镰刀型红细胞性贫血镰刀型红细胞性贫血 Institute of Genetic Engineering MMMM M 正常正常 Hb 镰刀型贫血镰刀型贫血 Hb 1.1k b 0.2kb 1.3 kb AA AS SS 1.3kb 1.1 kb 0.2 kb Institute of Genetic Engineering Institu

16、te of Genetic Engineering ： 一种特殊的串联重复，在不同个体和基因组的不同一种特殊的串联重复，在不同个体和基因组的不同 位点上数目都不同。在人类中位点上数目都不同。在人类中VNTRs位点是位点是15kb 的序列，此序列由长的序列，此序列由长15-100nt的重复单位组成。的重复单位组成。 小卫星小卫星DNA；DNA指纹法指纹法 : 14bp，微卫星，微卫星DNA 数量多、分布均匀、易于检测数量多、分布均匀、易于检测 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Biological

17、Sample Analyze dataScanner microarray “Hybridize ” arrayer Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 最直接、最准确最直接、最准确 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Enginee

18、ring Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 核酸分子杂交核酸分子杂交 PCRPCR DNADNA芯片技术芯片技术 外源基因的检测外源基因的检测 v潜伏期内诊断，潜伏期内诊断， v病原体分类、分型鉴定病原体分类、分型鉴定 v病原微生物流行病学筛查病原微生物流行病学筛查 Institute of Genetic Engineering Institute of Genet

19、ic Engineering Institute of Genetic Engineering 亲子鉴定亲子鉴定 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering 亲子鉴定亲子鉴定 A A和和C C是亲生女儿；是亲生女儿；B B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D D为养女。为养女。 Institute of Genetic Engineering 一个一个DNA指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位 点的变异，因而点的变异，因而DNA指纹指纹更能反映基因组的特异性；更

20、能反映基因组的特异性； 具有高特异性具有高特异性，只有同卵双生子女才会有完全相同的，只有同卵双生子女才会有完全相同的 指纹；指纹； 具有稳定的遗传性具有稳定的遗传性，通过家系分析表明，通过家系分析表明，DNA指纹谱指纹谱 中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产中几乎每一条带都能在双亲之一的指纹谱中找到，而产 生新带的概率仅为生新带的概率仅为0.001%0.004%之间；之间； DNA指纹图谱指纹图谱具有体细胞稳定性具有体细胞稳定性，即从同一个体中不，即从同一个体中不 同组织、血液、肌肉、毛发、精液等产生的同组织、血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹完指纹完 全一样。全一样。 Institute of Genetic Engineering ( (s single i