帖航,乳糖操纵子

1、2021-6-181乳糖操纵子的结构及其正负调控乳糖操纵子的结构及其正负调控天津商业大学天津商业大学 生物工程类生物工程类10021002班班帖航帖航2021-6-182一.乳糖操纵子的提出 大肠杆菌可以利用大肠杆菌可以利用葡葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，繁殖，当培养基中含有当培养基中含有葡葡萄糖和乳糖萄糖和乳糖时，细菌时，细菌优先优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过尽，细菌停止生长，经过短时间的短时间的适应适应，就能利用，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。繁殖增长。

2、 葡萄糖效应（葡萄葡萄糖效应（葡萄糖阻遏或分解代谢物阻糖阻遏或分解代谢物阻遏作用遏作用 ），大肠杆菌的），大肠杆菌的2次生长。次生长。2021-6-183 这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lac operon）学说，在1965诺贝尔医学生理学奖。Franois Jacob Jacques Monod 2021-6-184二、乳糖操纵子的基本组成 乳糖操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单乳糖操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由元，由调节

3、基因调节基因、启动子（启动子（P）、操作区（操作区（O）、结构基因结构基因、和和终止子终止子和组成。和组成。2021-6-185结构基因群 操纵子中被调控的编码蛋白质的基因称为结构基因(structural gene, SG)。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(open reading frame), 5端有起始密码ATG，3端有终止密码TAA、TGA或TAG。 Z基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列。由于、三个基因头尾相接，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，一气依次合成这基因群所编码所有

4、的蛋白质。2021-6-186 基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖； 基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌； 基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。 2021-6-187启动子启动子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基

5、因5侧上游，控制整个结构基因群的转录。2021-6-188操纵区操纵区 操纵区（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。Promotor: -84-+ 1Operator: -7-+28两者有7bp重叠，使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合，但无法形成开放的转录起始复合物2021-6-189调控基因 调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。调控蛋白有： 阻遏蛋白(repressive protein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基

6、因转录，其介导的调控方式为负调控(negative regulation), ； 激活蛋白(activating protein)（或无辅基诱导蛋白（apoinducer) ）：与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录，所介导的调控方式为正调控(positive regulation)。 乳糖操纵子中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的阻遏蛋白R。2021-6-1810终止子 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后

7、面有一个终止子。2021-6-1811 终止子都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting element）。调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），调控基因就属于反式作用元件（trans-acting element），其编码产生的调控蛋白称为

8、反式调控因子（trans-acting factor）。 由此也可窥测到基因表达调控机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。2021-6-1812二、二、乳糖操纵子的表达调控乳糖操纵子的表达调控 1. 阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白的负调控2. CAP的正调控的正调控2021-6-18131. 阻遏蛋白的负调控 当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与偶尔

9、解离，使细胞中还有极低水平的半乳糖苷酶及透过酶的生成。P structural genes OlacZ lacY lacAIR2021-6-1814 当有乳糖存在时，乳糖受 半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与的亲和力，与解离，基因转录开放，使 半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。lacZ lacY lacAIPOR2021-6-18152. CAP的正调控 细菌中的cAMP（环化腺苷酸）含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cA

10、MP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)，当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP(CRP-cAMP activated protein)(分解代谢基因激活蛋白)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 CAP结合位点（CAP binding site）在lac操纵子的启动子Plac上游端，当CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，la

11、c操纵子的结构基因表达下降。2021-6-18162021-6-1817 由此可见，正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体为适应环境而进行的一种协同机制。 Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。2021-6-1818 无葡萄糖无葡萄糖 cAMP浓度高浓度高mRNA无乳糖时无乳糖时有乳糖时有乳糖时 有葡萄糖有葡萄糖

12、cAMP浓度低浓度低RNA-polOOOOlaclac操纵子基因表达既需要乳糖又需缺乏葡萄糖操纵子基因表达既需要乳糖又需缺乏葡萄糖2021-6-1819Summary2021-6-1820利用利用lacZ基因的插入失活筛选重组子基因的插入失活筛选重组子蓝白筛选法蓝白筛选法 载体同时含氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因基因，外源基因插在lacZ基因内，受体细胞为lacZ 基因互补菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（ X-gal）的平板上筛选： 未转化细胞不能生长； 空载体转化菌长成蓝色菌落； 重组子长成白色菌落。lacZ基因编码-半乳糖苷酶； lacZ基因编码-半乳糖苷酶的N端端序列片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端端片断，两者互补（-互补）形成有功能的全酶。补充内