第10章_高效液相色谱分离检测技术

1、4.4 4.4 高效液相色谱分离方式高效液相色谱分离方式 HPLC 分离方式分离方式 液谱分离系统液谱分离系统 液固吸附色谱液固吸附色谱 分配色谱分配色谱 离子交换和离子色谱离子交换和离子色谱 离子对色谱离子对色谱 体积排阻色谱法体积排阻色谱法 亲合色谱法亲合色谱法 1 1、固定相（柱填料）、固定相（柱填料） 常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。 硅胶是硅胶是HPLC HPLC 填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好 的化学稳定性和热稳定性以

2、及专一的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰 富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。 缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。 4.4.1 液谱分离系统液谱分离系统 目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离多孔壳层：在常规液相色

3、谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析普通快速分析 5.0m 常规分析常规分析 颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。 1. 1. 液液- -液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。 （2 2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着 一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小

4、，柱容量底。 4.4.1 液谱分离系统液谱分离系统 HPLC 固定相状态分固定相状态分 液液-固色谱法（固色谱法（LSC） 液液-液色谱法（液色谱法（LLC） 分离机制分分离机制分 吸附色谱法吸附色谱法 分配色谱法分配色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法 分子排阻色谱法分子排阻色谱法 化学键合相色谱法化学键合相色谱法 亲合色谱法亲合色谱法 离子色谱法离子色谱法 一、化学键合相色谱法一、化学键合相色谱法 化学键合相（化学键合相（chemically bonded phase）将固定液（含不将固定液（含不 同官能团的有机分子）利用化学反应键合到同官能团的有机分子）利用化学反应键合到载体载体表面上，

5、使表面上，使 其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相 1键合相类型键合相类型 载体载体-硅胶硅胶 类型类型 非极性固定相非极性固定相 (ODS） 极性键合相极性键合相 （键合键合-NH2、-CN、醇基等极性基团）、醇基等极性基团） 离子型键合相离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团键合可交换阴或阳离子基团 ) ClSi R1 R2 C18H37 -HCl OH +Si OSi R1 R2 C18H37Si 键合反应键合反应-硅烷化反应、硅酸酯化反应硅烷化反应、硅酸酯化反应 2分离原理分离原理 （1）正相键合相色谱法）正相键合相色谱法 特征特征-固

6、定相极性流动相极性固定相极性流动相极性 分离机制分离机制 -类似液类似液-液分配色谱的分离原理液分配色谱的分离原理 应用范围应用范围-适于分离溶于有机溶剂的适于分离溶于有机溶剂的 极性至中等极性的分子型化合物极性至中等极性的分子型化合物(如脂如脂 溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等） （2）反相键合相色谱法）反相键合相色谱法 特征特征-固定相极性流动相极性固定相极性流动相极性 分离机制分离机制 -“疏溶剂作用疏溶剂作用”理论理论 应用范围应用范围-适用于分离非极性至适用于分离非极性至 中等极性的分子型化合物中等极性的分子型化合物 流动相流动相-有机溶剂有机溶剂

7、流动相流动相-水水+有机调节剂有机调节剂 疏溶剂作用理论疏溶剂作用理论 利用非极性溶质分子或利用非极性溶质分子或 溶质分子中非极性基团和极溶质分子中非极性基团和极 性溶剂接触时产生排斥力，性溶剂接触时产生排斥力， 而从溶剂中被而从溶剂中被“挤出挤出”，即，即 产生疏溶剂作用，促使溶质产生疏溶剂作用，促使溶质 分子与键合相表面的非极性分子与键合相表面的非极性 的烷基发生疏水缔合，而使的烷基发生疏水缔合，而使 溶质分子保留在固定相中溶质分子保留在固定相中 . 想一想想一想 影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些? （1）溶质分子中非极性部分的总表面积）溶质分子中非

8、极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈 弱，疏水性越强，保留值越大。弱，疏水性越强，保留值越大。 （2）键合相上的烷基总面积）键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长， 烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大碳链长度的增加而增大。 影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素 时间，时间，min 固

9、定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18 1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯 （3）流动相的表面张力）流动相的表面张力 流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强； 溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱， 导致溶质的保留值大。导致溶质的保留值大。 （4）流动相的酸碱性和盐浓度流动相的酸碱性和盐浓度 酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增酸性抑制弱酸解离，增加保留时

10、间；碱性抑制弱碱解离，增 加保留时间；盐浓度增加加保留时间；盐浓度增加不利于不利于离子化溶质保留。离子化溶质保留。 二、离子色谱法二、离子色谱法 1.离子色谱法离子色谱法（IC） 离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法 2分离原理分离原理抑制型（双柱型抑制型（双柱型) 分离柱分离柱 交换反应：交换反应：R+-OH- + NaX R+-X-+ NaOH 洗脱反应：洗脱反应：R+-X- + NaOH R+-OH-+ NaX 抑制柱抑制柱 与组分反应：与组分反应：RH+ + NaX R-Na+ + HX 与洗脱剂反应：与洗脱剂反应：R-H+

11、+ NaOH R-Na+ + H2O 在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂 NaOH及被洗脱的组分及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高 本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率很本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率很 低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。 2固定相与流动相固定相与流动相 （1）固定相）固定相 基质基质 -合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶合成树

12、脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 离子交换剂离子交换剂 -键合的离子交换基团键合的离子交换基团 类型符号官能团 强阳离子交换剂SCXSO3H 弱阳离子交换剂WCXCOOH 强阴离子交换剂SAXN+R3 弱阴离子交换剂WAXNH2 （2）流动相）流动相-水缓冲溶液水缓冲溶液 选择规则选择规则 (1)(1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力， 使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留反之，则保留 时间增大，后出色谱柱时间增大，后出色谱柱 . （2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，

13、保留时间增加，后增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后 出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小，出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小， 先出柱。先出柱。 (3)(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。保留时间会减小。 三、反相离子对色谱法三、反相离子对色谱法 1分离机制分离机制 在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离 子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏

14、水性（中性 或弱极性）的离子对缔合物或弱极性）的离子对缔合物 ,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相 被保留被保留 .因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离 子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色 谱柱先后不同，实现分离谱柱先后不同，实现分离. 生成离子对反应生成离子对反应 A-(水 相 ）+ B+(水 相 ）A-B+(有 机 相 ） 反离子反离子被测离子被测离子 2常用常

15、用 离子对离子对 试剂试剂 阳离子阳离子 烷基磺酸或盐类烷基磺酸或盐类 ( (十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠 ） 分析有机碱类和有机阳离子分析有机碱类和有机阳离子 阴离子阴离子 季铵盐类季铵盐类 (四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐 ) 分析有机酸和有机阴离子分析有机酸和有机阴离子 3固定相与流动相固定相与流动相 (1(1）固定相）固定相 -ODS等非极性固定相等非极性固定相 (2(2）流动相）流动相 -甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水体系中加入适量离子对试水体系中加入适量离子对试 剂，并用缓冲液调至合适的剂，并用缓冲液调至合适的pH。分离有机碱的分离有机碱的pH

16、值一般为值一般为 33.5；分离有机酸的；分离有机酸的pH值一般在值一般在7.5左右。左右。 第第2节节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪结构及流程高效液相色谱仪结构及流程 一、输液系统一、输液系统 单柱塞往复泵结构示意图单柱塞往复泵结构示意图 1高压输液泵高压输液泵 单柱塞往复泵单柱塞往复泵 双柱塞往复泵双柱塞往复泵(串或并联串或并联） 恒压泵恒压泵(淘汰淘汰) 恒流泵恒流泵 2梯度洗脱装置梯度洗脱装置 内梯度内梯度-高压泵将溶剂按程序压入混合室，高压泵将溶剂按程序压入混合室， 混合后再注入色谱柱混合后再注入色谱柱 外梯度外梯度-多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱多元溶剂通过比例

17、阀再由泵注入色谱柱 二元二元内梯度洗脱内梯度洗脱装置示意图装置示意图 四元四元外梯度洗脱外梯度洗脱装置双泵装置双泵(串联串联)工作原理示意图工作原理示意图 3洗脱方式洗脱方式 等度洗脱等度洗脱 梯度洗脱梯度洗脱 想一想想一想 分别在何种情况下选择等度或梯度洗脱分别在何种情况下选择等度或梯度洗脱? 二、进样系统二、进样系统 1六通阀进样器六通阀进样器 2自动进样器自动进样器 三、分离系统三、分离系统 1色谱柱类型色谱柱类型 常量柱内径24.6mm，柱长1025cm 半微量柱：内径11.5mm，柱长1020cm 毛细管柱：内径0.51mm，柱长3075mm 分析型柱 制备型柱制备型柱 内径内径20

18、40mm，柱长，柱长1030cm 分析型分析型 制备型制备型 2填充剂填充剂-最最常用填充剂为化学键合硅胶常用填充剂为化学键合硅胶 四、检测系统四、检测系统 1.紫外检测器紫外检测器 可变波长检测器可变波长检测器 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器结构与光路示意图光电二极管阵列检测器结构与光路示意图 三维色谱图三维色谱图 2电化学检测器电化学检测器 介电型介电型 -测量两电极之间电容介质的介电测量两电极之间电容介质的介电 常数变化测得组分浓度常数变化测得组分浓度 电导型电导型 -测电导率变化来测量电离物质含量测电导率变化来测量电离物质含量 电位型电位型 -测定电流为

19、零时电极间的电位差值测定电流为零时电极间的电位差值 安培型安培型 -测定电极间的电流变化而测定样品测定电极间的电流变化而测定样品 浓度浓度 典型电化学检测器示意图典型电化学检测器示意图 3蒸发光散射检测蒸发光散射检测 ELSD是基于是基于 光线通过微小光线通过微小 粒子时会产生粒子时会产生 光散射的现象光散射的现象 蒸发光散射检测器工作原理示意图蒸发光散射检测器工作原理示意图 五、数据记录及处理系统（五、数据记录及处理系统（类似于类似于GC)GC) 第第3节节 定性与定量分析技术定性与定量分析技术 一、定性分析技术一、定性分析技术 1色谱鉴定法色谱鉴定法 2两谱联用鉴定法两谱联用鉴定法 LC-

20、UV LC-MS 二、定量测定分析二、定量测定分析(外标法、内标法）外标法、内标法） 1.加校正因子的主成分自身对照法加校正因子的主成分自身对照法 (1)校正因子测定与计算校正因子测定与计算 主主 杂杂 cA cA f / / (2(2）测定）测定 测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质 限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对 照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限） 或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色或

21、进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色 谱峰的峰高约达满量程的谱峰的峰高约达满量程的10%25%或其峰面积能准确积或其峰面积能准确积 分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特 殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰 保留时间的保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面 积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面 积比较，依法计算各杂质含量。积比较，依法计算各杂质

22、含量。 2不加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法 按上述（按上述（1）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后， 取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量 标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应 为主成分色谱峰保留时间的为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中倍，测量供试品溶液色谱图中 各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计 算杂质的含量。算杂质的含量

23、。 第第4节节 高效毛细管电泳简介高效毛细管电泳简介 一、毛细管电泳分离原理简介一、毛细管电泳分离原理简介 1.电泳流电泳流 (电泳电泳) -在电解质溶液中，带电粒子在电场作用在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移 2.电渗流电渗流 （电渗电渗) ) -在一般性况下（在一般性况下（pH3）石英毛）石英毛 细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层;在高在高 压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方 向移动向移动 3.粒子迁移速度

24、粒子迁移速度 电渗流的速度电渗流的速度= 57倍电泳流速度倍电泳流速度 阳离子迁移速度阳离子迁移速度电渗速度电渗速度电泳速度电泳速度 阴离子迁移速度阴离子迁移速度电渗速度电渗速度电泳速度电泳速度 中性粒子迁移速度中性粒子迁移速度电渗速度电渗速度 4.分离原理分离原理 在一定电场作用下在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子在毛细管中的各种不同的粒子 电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离 子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实 现分离。现分离。 二、毛细管电泳仪的基本装置二、

25、毛细管电泳仪的基本装置 毛细管柱、柱恒温毛细管柱、柱恒温 系统、电解液槽、系统、电解液槽、 进样器、高压电源、进样器、高压电源、 检测器和数据处理检测器和数据处理 器器 毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图 1毛细管柱及温度控制毛细管柱及温度控制 （1）毛细管柱）毛细管柱 空心柱空心柱 -区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳 填充毛细管柱填充毛细管柱 -电色谱电色谱 壁处理柱壁处理柱 -蛋白质电泳蛋白质电泳 （2）毛细管恒温装置）毛细管恒温装置 作用作用-消除电泳产生的焦耳热消除电泳产生的焦耳热 精度精度-0.1 恒温方式恒温方式 高速气流恒温高速气流恒温 液体恒温

26、液体恒温 2高压电源高压电源 直流电源直流电源 电压电压:030kV 稳定性稳定性:0.1% 电流强度电流强度:200300mA 电源极性切换装置电源极性切换装置 (双极性电源双极性电源) 3毛细管电泳进样方法毛细管电泳进样方法 流体进样流体进样 进样端加压进样进样端加压进样 出口端真空进样出口端真空进样 高差进样高差进样 电动进样电动进样 （瞬间高压脉冲进样（瞬间高压脉冲进样) 4电极和溶液控制系统电极和溶液控制系统 (1(1）电极电极-置于两侧的电泳池中铂丝电极置于两侧的电泳池中铂丝电极 (2(2）溶液控制系统溶液控制系统 自动进样器自动进样器 分部收集器分部收集器 更换缓冲液装置更换缓冲液装置 缓冲液的水平系统缓冲液的水平系统 5检测器检测器 紫外紫外-可见光检测器可见光检测器 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 荧光检测器荧光检测器 质谱检测器质谱检测器 电化学检测器电化学检测器 激光类检测器激光类检测器 三、毛细管电泳法的模式及应用三、