胰岛素生物黏附性壳聚糖凝胶的鼻腔给药

1、.胰岛素生物黏附性壳聚糖凝胶的鼻腔给药摘要：近来有许多研究开始针对于壳聚糖生物黏附凝胶用于胰岛素鼻腔给药，采用鼻腔灌注试验进行毒性和四个吸收促进剂的研究：皂角甙，sodium deoxycholate，ethylendiamine，EDTA和卵磷脂。凝胶包括了4000lu/dl胰岛素，2%或4%的低或中等分子量的壳聚糖，卵磷脂或EDTA。药物释放可以通过无膜扩散方法研究，生物黏附性通过改良的张力测定，最优化的凝胶通过糖尿病大鼠鼻腔制备。血浆胰岛素水平通过胰岛素酶免疫测定工具分析，血浆糖水平通过葡萄糖氧化酶方法测定。处方包括2%低分子量含EDTA的壳聚糖，与含4%的含卵磷脂的中等分子量壳聚糖凝胶

2、相比，具有高释放百分比，分散效率2.5%，低的T50%（释放50%的药物所需要的时间），平均溶出时间和生物黏附性。胰岛素从凝胶中零级动力学释放。2%的含EDTA的中等分子量壳聚糖能使胰岛素吸收的增加，静脉中葡萄糖水平下降46%。考虑我们体内外的研究，我们提出的凝胶处方是一个胰岛素鼻腔控释给药有用的制剂。关键词： 吸收促进剂，壳聚糖凝胶，胰岛素，鼻腔给药，灌注鼻腔给药是全身给药的最引人注意的途径之一。因为非胃肠道给药用于慢性治疗有很多缺点，鼻腔动脉血管丰富，因此药物可以快速吸收，组织高渗透，快速起效，给药方便，为大多数人所熟悉，适于慢性病药物治疗和避免首过效应的代谢。然而近来这种途径明显可以用于

3、不稳定的，只能通过非胃肠道途径给药的药物。例如，狗的胰岛素鼻腔给药，血中免疫反应性胰岛素水平有显著的提高，而且，鼻腔中胰岛素的吸收可以通过加入吸收促进剂来实现，如胰岛素溶液中加入表面活性剂等。而且直肠给药的聚乙烯酸水凝胶基质可以改进多肽激素的吸收，比如胰岛素和降血钙素。有很多方法可以用于提高胰岛素在鼻腔中的驻留时间，很多都是使用thermogelling polymer ethyl(hydroxyethyl)纤维素凝胶，Pluronic F-127，它作为一种溶液形式给药，但是在温度上升时迅速形成半固体的凝胶网络，还有polyacrylic acid水凝胶等。然而，鼻腔给药多肽和蛋白的生物利用

4、度，包括胰岛素在内，都很低，因为他们的大分子量和亲水性。药物穿过鼻粘膜的弱吸收是因为这些原因如大分子聚合物在鼻粘膜的低渗透性，粘膜纤毛的清除，所以药物很快被清除了，还有酶降解等。这些限制能够通过使用渗透促进剂，生物黏附性高分子增加鼻腔中的驻留时间，酶抑制剂来保护药物不受酶降解。壳聚糖是-(1 4)-linked 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose 和2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose的共聚物。这种聚阳离子生物高聚物一般有甲壳通过碱脱乙酰作用获得。它是甲壳类如虾等外骨骼的主要组成部分。影响壳聚糖性质的主要的参数是他的分子量和脱乙酰度

5、，它表现的是脱乙酰单元所占的比例。这些参数由制备时的条件所决定。而且，他们能通过进一步的修饰，如脱乙酰度可以通过乙酰化来降低，分子量可以通过酸解聚来降低。这是一个适合的凝胶产品的生物降解基质，归功于它的生物相容性，生物降解能力，生物黏附性质，尤其是它的氨基集团的共价交联的可能性。最后的质量决定了它能够作为一种控释系统基质的稳定性。鼻腔胰岛素生物利用度可以通过吸收促进剂的共同给药来提高。如表面活性剂，胆酸盐，fusidate衍生物，中链脂肪酸，磷脂，甘油，甘油酸，chilating agents，环糊精等。许多化合物不适于胰岛素通过鼻腔给药的长期治疗，因为他们对鼻上皮粘膜有副作用，而且影响了鼻纤

6、毛的运动。我们工作的目的就是研究胰岛素以壳聚糖凝胶作为生物黏附性聚合物的鼻腔吸收。它可以增加药物的驻留时间并作为吸收促进剂，除了壳聚糖0.5%的溶液的使用，使得羊的胰岛素AUC提高了七倍以外，据我们所知，还没有其他关于壳聚糖凝胶胰岛素鼻腔给药的其他报道。材料和方法壳聚糖(Mw=150000, and 400000, Fluka, Swithzerland)，人的锌胰岛素(26 IU/mg, Li-Lilly, France)，去氧皮质酮纳，卵磷脂，EDTA，皂角甙，氯仿，磷酸二氢钾，氢氧化钠，正己烷，碳酸钠，硫酸铜，酒石酸钠钾，sodium tangstate,，sodium molibdat

7、e，磷酸，盐酸，硫酸锂，溴，冰醋酸，Halotane，ketamine，streptozotocin，RIA-based insulin kit，glucose kit灌注试验MW大鼠重量250-300g，吸入halotan后腹腔注射可它命50-75mg/kg诱导麻醉，颈部切口暴露气管，通过食道从鼻后腔插入聚乙烯管（直径1-1.5mm），注意不要伤到组织，nasopalatine管末端用棉花封闭，用粘合剂防治灌流液流到口腔中。促进溶液通过pristaltic泵以2.5ml/min给到鼻孔中，在容器中汇集。给与的促进剂为1%的去氧皮质酮钠，卵磷脂，EDTA，皂角甙磷酸盐缓冲液（pH7.4）。保留

8、的溶液在灌注后15，30，45，60，75，90，105，120分钟时间间隔以Lowry方法分析从鼻腔粘膜释放的蛋白。测量500nm处的吸收度，磷酸盐缓冲液用作控制，每种促进剂重复测试四次。凝胶的准备编号 聚合物浓度 聚合物种类 吸收促进剂 L2E2%L.M.CH EDTA L4E4%L.M.CH EDTA L2L2%L.M.CH 卵磷脂 L4L4%L.M.CH 卵磷脂 M2E2%M.M.CH EDTA M4E4%M.M.CH EDTA M2L2%M.M.CH 卵磷脂 M4L4%M.M.CH 卵磷脂 表1 胰岛素凝胶的研究处方壳聚糖溶于2%的醋酸溶液，4000Iu/dl的胰岛素溶于凝胶。促进溶

9、液加入到凝胶中，重量比为1%，最终的pH值调为5.5，图一表示的是三种处方参数在全部因子设计和不同的研究处方两种水平的研究。药物释放的研究体外研究有一种无膜分散方法。包含胰岛素的壳聚糖凝胶转移到试管里放置在37度水浴中。2ml的释放介质（PBS，pH7.4），在实验温度下预平衡，凝胶表面分层，在预定的取样时间将表面层取出，用新鲜的溶液替换，保证漏槽条件。在样品离心过滤后分析胰岛素的浓度，500纳米处于空白凝胶作对照。Peppas等式用于找出释放机制( Mt/M = knt)，n是扩散指数。药物释放动力通过最佳曲线拟合的方法来建立，比较释放数据与零级一级或Higuchi模型的相关系数。凝胶黏附性

10、的测试。基于Fisher张力计改良的张力测定方法的可以用于评价凝胶的生物黏附性凝胶。这个仪器测定表面张力和黏附力的限制在0-100dyn/cm2，仪器的强度以不能使界面的云母玻璃盘断裂为限。通过装置目录，在这种限制下装置能够承受1g的重量，所以云母盘的重量对云母盘没有问题，不会引起断裂。在张力计用标准重量校准后，进行如下操作：薄的玻璃盘通过氰基丙烯酸盐粘合剂附在张力剂的盘上，蘸入凝胶中，两面包裹凝胶制剂，37度干燥至恒重。包裹3次，包好生物黏附凝胶的盘浸入1%的粘液样品中，放置在装置的37度水浴玻璃瓶中，接触到容器的底部。盘留在粘液溶液中一分钟。盘子以0.2in/min的速度取出溶液。分离盘所

11、需的最大力以dyn/cm2来测定。测试重复至少4次。不包裹的玻璃盘和底层溶液之间的黏附力用作空白，用于以后所有凝胶样品的测试。在每个实验后，仪器的目录推荐玻璃盘都要取出，而且张力计的钯环使用甲醇，再用乙酰来清洗，为了保证将遗留的污染物全部清除，要在火焰上加热至白色。体内吸收试验MW大鼠体重250-300g禁食12小时，通过腹腔注射60mg/kg的链脲霉素制成糖尿病模型，10天后，大鼠通过吸入halotane麻醉，紧接着，腹腔注射0.1-1ml的可它命。脖子上做切口，气管插管，从始到终在向鼻腔后部插一根管，用于给药。Nasopalatine是用粘合剂封口，防止药物从鼻腔到口腔的排出，手术后，胰岛

12、素凝胶（制剂M2E）通过鼻腔以100 l/kg的凝胶含有4000 Iu/dl通过负载空气注射器上的管子给药。另一组给予空白凝胶。第三组B4Iu/kg的胰岛素静注给药。A组不处理。每个处理组都包含有6只大鼠，以获得可靠的结果。在胰岛素给药后血样（0.6ml）在0，3，30，75，120，180和240分钟时通过心脏收回。3000g离心10分钟后，血浆分离并在-20度时冷冻，用于分析胰岛素和糖的免疫活性。血浆胰岛素和血浆葡萄糖的测定。血浆免疫活性胰岛素通过PIA工具包进行双抗体放射性免疫测定。血糖水平通过葡萄糖氧化酶或过氧化酶测定。数据分析血浆胰岛素和糖浓度时间下曲线下面积通过0-24h线性梯形方

13、法来计算，吸收的鼻腔生物利用度也通过比较鼻腔AUC与静注AUC，血糖水平0-240h的百分消耗通过血糖在鼻腔给药和静脉注射后下降的AUC来获得。结果扩散试验吸收促进剂的种类AUC15120控制组12.0975 2.6158皂角甙49.6369 2.6462EDTA13.3200 1.6703卵磷脂4.0669 0.4087脱氧胆酸钠94.3444 9.4859表2 与不同的吸收促进剂接触后老鼠鼻腔粘膜的蛋白分泌物时间吸光率曲线下的面积表2概述了测定与不同的吸收促进剂接触后15-120分钟之间老鼠鼻腔粘膜的蛋白分泌物时间吸光率曲线下的面积。结果表现了卵磷脂和EDTA之间最小的差异。因此，这两种促

14、进剂是鼻腔凝胶的安全材料。药物释放的研究图1表示的是胰岛素2%和4%的低或中等分子量壳聚糖凝胶使用卵磷脂或EDTA做吸收促进剂的释放曲线，图二比较了包含卵磷脂或EDTA的不同浓度和不同种类的壳聚糖。通过Peppas等式，所有的情况下药物释放的机制遵循非Fickian机制（0.85n0.5）除了n为0.9的L4E，M4L，和M4L，这时第2种机制占优势。适宜的最佳曲线的结果表现了除了L2L和M2L外跟适于Higuchi模型外，所有的制剂都遵循零级释放。比较释放研究的结果，许多释放参数如T50%，DE2.5%和MDT都在表三种进行了比较。T50%的评价显示了不同的处方除了M4L与L2E, L4E,

15、 L2L, M2E, M4E, and M2L外没有显著性差异。DE2.5%在所有研究的凝胶中除了L2E with M2L, L4E with L4L and M4E, L2L with M2L, L4L with L4E and M4E外有显著性差异。然而MDT表示不同的凝胶间没有显著性差异，除了M4L with L2E, L2L, M2E, and M2L。凝胶粘膜黏附性图三显示的是壳聚糖凝胶粘膜黏附性的结果。这个图显示，咸面的顺序是壳聚糖凝胶黏附性的顺序L4E; M4E; M4L;M2E; M2L; L2E; L4L; L2L.然而，粘膜黏附性的统计学分析表现出了研究直接见的显著性差异，

16、除了L2E with L4L, M2L, and M2E with M4E, M2L, M4L and M4E with M4L, and M2L with M2E and M4L。体外吸收试验图4表示的是4个糖尿病大鼠组的血浆葡萄糖，图5是血浆胰岛素水平。表4比较了一道苏德生物利用度和血糖水明的下降，与静注给药组作比较。在所有的情况下，胰岛素血液水平表现了组与组之间的显著的不同，除了A与C，未治疗组与鼻腔空白凝胶。讨论鼻腔胰岛素生物利用度可以通过吸收促进剂的同时给药来提高。然而，许多这样的化合物对鼻腔上皮粘膜有害，妨碍了鼻腔纤毛的运动，不适合鼻腔胰岛素给药的长期治疗。当吸收促进剂显著的提高药

17、物的摄取的时候，根据蛋白释放，纤毛毒性和组织学考察，他们表现做出显著的粘膜破坏性。为了研究吸收促进剂的破坏效应，灌流液中的蛋白在不同的取样点上都要通过Lowry方法来测定。比较使用不同的吸收促进剂后大鼠鼻腔粘膜蛋白分泌的蛋白在15-120min时间吸收度曲线下面积。表2表示EDTA和卵磷脂没有统计学差异，都是凝胶制剂的安全促吸收剂。使用卵磷脂制备的含2%的低中分子量的壳聚糖凝胶使用Higuchi模型药物释放更快，0级释放模型下，T50%和MDT比EDTA更小，包含EDTA的4%的凝胶释放胰岛素比卵磷脂更快，T50%和MDT，EDTA比卵磷脂更大。2%和4%之间的不同可以归因于卵磷脂和壳聚糖之间

18、磷脂-糖在高浓度下的交互作用，而2%的时候可以忽略。这种现象也在细胞膜中有发现，可能是引起了网络，减小了在4%壳聚糖的凝胶中的药物的释放。所有这些研究都不同，他们的相互作用对T50%，MDT和凝胶的黏附性非常有效。然而，只有壳聚糖种类和浓度（不是促进剂的种类）和3种因素的相互作用对DE2.5%有显著影响。总而言之，从释放参数和粘膜黏附性测定的两种途径的ANOVA试验，我们可以总结出，提高壳聚糖的浓度和分子量，或把EDTA换成卵磷脂，胰岛素的释放速率和黏附性就会下降。考虑到释放速率和凝胶的粘膜黏附性，M2E制剂在2.5小时释放了90%的药物，0级释放，有很好的生物黏附性，他可以用于大鼠的吸收的研究。表4显示了鼻腔粘膜能够像静注给药46%的有效，EDTA和壳聚糖两种成分的存在，促进了胰岛素的吸收，EDTA是一个2价阳离子螯合剂。尤其是钙离子和镁离子对于保持结构和细胞膜的钢性，纤毛的活性很重要。这可能会增加细胞内空间的水流量，并通过solvent-drag机制促进亲水溶质如胰岛素的吸收，包括增加吸收部位的血流或浓度梯度。EDTA还可以通过螯合蛋白酶酯酶必需的二价阳离子来抑制吸收部位的蛋白酶。另外，壳聚糖它是生物黏附性多糖，能够延长药物与粘膜