发酵工业中噬菌体的防治

1、发酵工业中噬菌体的防治发酵工业中噬菌体的防治 噬菌体简介 染菌后（噬菌体，下同）症状 染菌的原因 应急的挽救措施 噬菌体的预防 抗噬菌体菌株的选育噬菌体 噬菌体是原核生物病毒。非常微小，其直径为0.1m；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。它的感染能力非常强，极易感染用于发酵的细菌和放线菌。传播蔓延的速度非常快，且很难防治，对发酵产生有巨大的威胁。它可以通过环境污染、设备的渗漏或死角、空气系统、培养基灭菌过程、补料、取样及其他操作过程进入到发酵系统中。 噬菌体在侵染宿主细胞时，首先是吸附在宿主细胞表面，然后将核酸注入到细胞内部，衣壳则留在外面。核酸进入宿主细胞以后，就利用宿主细胞内的物质，复制

2、出子代噬菌体的核酸，并合成构成子代噬菌体衣壳的蛋白质。在细胞的一定部位，这些蛋白质和核酸装配成子一代噬菌体。装配完成的噬菌体，在细胞裂解以后，一齐被释放出来，释放量通常在102103个左右。还有一种温和噬菌体，进入宿主细胞后其基因组能与宿主菌基因组整合，并随细菌分裂传至子代细菌的基因组中，不引起细菌裂解。整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体，带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌。前噬菌体偶尔可自发地或在某些理化和生物因素的诱导下脱离宿主菌基因组而进入溶菌周期，产生成熟噬菌体，导致细菌裂解。温和噬菌体的这种产生成熟噬菌体和溶解宿主菌的潜在能力，称为溶原性。温和噬菌体可有三种存在状态：游

3、离的具有感染性的噬菌体；宿主菌胞质内类似质粒形式的噬菌体核酸；前噬菌体。发酵工业中所涉及的噬菌体主要属于细菌和放线菌噬菌体。细菌噬菌体所涉及的发酵工业较多，如氨基酸、酶制剂、以及酸乳制品等生产 而放线菌嗟菌体主要出现在抗生索发酵工业中。菌体感染了噬菌体导致发酵不正常进行，甚至倒灌。其主要症状有： 菌体生长受到影响，发酵液（OD值）光密度不上升或回降 pH逐渐上升 氨利用停止 糖耗、温升缓慢或停止 产生大量泡沫，是发酵液呈黏胶状 镜检时菌体数量显著减少，甚至找不到完整的菌体 发酵周期延长、产物生成量减少或停止染菌症状 环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。 设备渗漏或死角，管道的弯曲和焊接处

4、灭菌不彻底。 在发酵工程中操作不当使得噬菌体进入发酵系统。染菌的原因上海味精厂噬菌体污染因素的分析在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确判断，及可能快采取相应的挽救措施。常用的应急方法有一下几种： （1） 加入螯合剂如草酸及柠檬酸或抗生素（适用于耐药的生产菌） （2）适量补入新鲜的发酵培养基或生长因子（玉米浆、酵母膏） （3）大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵至终点，以防止倒灌。在补种之前也可对已感染了噬菌体的发酵液低温灭菌。应急的挽救措施例：谷氨酸发酵中期污染噬菌体的挽救措施例：谷氨酸发酵中期污染噬菌体的挽救措施（沈阳味精厂）谷氨酸发酵

5、时若中期染噬菌体，如果返消，则得不偿失;如果实罐灭菌重新接种，虽然杀死了噬菌体，但是，发酵液pH很高，既使用酸中和下来，也会由于盐类物质积累过多，造成菌体不适，不利发酵。另一方面由于实消后，接进去的是幼龄菌种不是产酸型菌体，因此，未能使菌体增殖，底物就趋于耗尽，致使产物积累的不多。 针对上述问题，我们查阅了有关资料，结合生产实践，采取了“对流”的措施。经过多次实践，收到了较理想的效果。其做法是将发酵中期染噬菌体的罐(无杂菌)与另一正常发酵后期罐用管路接通，利用风压将二者对流混合，然后继续发酵。1.噬菌体吸附寄主细胞的能力不是均匀的。细菌同其它生物一样，对外来“异物”具有一定的抵抗能力。当然，这

6、种能力随菌龄不同.就谷氨酸发酵菌株而言一般认为，幼龄细胞抵抗能力较弱，壮龄、老龄细胞抵抗能力较强。“对流”的实践正是在这种观点的启发下进行的。2. . “对流对流”起到的交换作用起到的交换作用“对流”可以使染菌罐内相对过剩的营养物质(葡萄糖、生物素、无机盐等)补充到营养物趋于耗尽的正常后期内;同时将正常罐内的大量产酸型菌体补充到染菌罐内。3. 3.“对流对流”可缓解染菌罐可缓解染菌罐pHpH过高问题过高问题污染噬菌体，发酵液pH值升高，在对流前选择正常后期罐的同时尽量选择pH低的发酵罐，从而达到中和的目的，达到发酵所需的要求。关于“对流”的理论根据讨论优点： 1，不需重新灭菌或消毒过程。但必须

7、对有关的管道进行严密的消毒，防止“对流”过程的污染。可相对节省水和蒸汽。 2.不需额外添加任何营养物质，可相对节省原料。 3.它不是发酵的重新开始，而是在原有基础上的继续。因此，所消耗的时间比任何一种处理方法都短。 4.方法简便易行，成功率高。缺点： 采用“对流”方法的有不足之处是它扩大了污染面积，因此，必须做好后处理工作，防止噬菌体的扩散。“对流”的优缺点 (1) 合理使用抗性菌株 选育抗性菌株的标准： 对以前出现过的噬菌体都有抗性 不是溶原性菌株 具有与原菌株相当或更高的生产能力 不易发生回复突变噬菌体的防治 (2) 采取以环境净化为中心的综合防治措施 定期检查噬菌体 严禁活菌体任意排放

8、杀灭环境中噬菌体 杀灭压缩空气中噬菌体 避免噬菌体侵袭菌种 避免噬菌体侵入设备噬菌体的防治 (3) 污染后的挽救措施并罐法菌种轮换或使用抗性菌株放罐重消法罐内灭噬菌体法如果污染严重，上述方法无法解决，应调换菌种或停产全面消毒。噬菌体的防治 关于噬菌体的防治，最主要的还是以预防为主，生产上使用的菌种不让它在车间环境中长期蔓延，噬菌体就没有可寄生的活菌，也就没有噬菌体的滋长场地和繁殖条件。 我们可以通过抗噬菌体菌株的选育来达到预防的效果。抗噬菌体菌株的选育 烈性噬菌体短期内能连续完成对宿主的吸附、侵入、增殖、成熟和裂解而实现繁殖和裂解寄主。 噬菌斑烈性噬菌体侵蚀宿主细胞并在宿主内大量繁殖，释放出多

9、子代噬菌体，进而感染四周细胞，使其裂解死亡，形成一个肉眼可见的空斑。一半情况下每种噬菌体所形成的噬菌斑的形态是相对稳定的，可以最为鉴定指标，亦可利用其进行纯种分离和计数。 效价每毫升试样中所含有的侵染性噬菌体粒子数称为效价。抗噬菌体菌株的选育 重层琼脂法该法是检查、分离噬菌体常用的方法。具体方法：分别配置琼脂为该法是检查、分离噬菌体常用的方法。具体方法：分别配置琼脂为1%1%和和2%2%的宿主的宿主培养基，倒入平皿，制成底层，凝固后待用；在取含噬菌体待测样品培养基，倒入平皿，制成底层，凝固后待用；在取含噬菌体待测样品0.1mL0.1mL和和宿宿主的培养液混合，制成一定稀释度，吸取其中主的培养液

10、混合，制成一定稀释度，吸取其中0.1mL0.1mL加加入到盛有入到盛有3-4mL13-4mL1% %琼脂培养琼脂培养基的试管中，充分混匀，立即倒入平皿底层的培养基上，制成重层平板，然后置基的试管中，充分混匀，立即倒入平皿底层的培养基上，制成重层平板，然后置于宿主适宜的温度下培养于宿主适宜的温度下培养16-20h.16-20h.如有噬菌体时，在重层琼脂的上层形成透明的如有噬菌体时，在重层琼脂的上层形成透明的噬菌斑。噬菌斑。噬菌体的检测方法重重层琼脂法层琼脂法 单层平板法单层平板法 有时为了大概了解样品中是否存在噬菌体而并不要求计数，可以把重层法简化为单层法，即把待测样品、敏感菌与上层培养基混合，

11、直接倒入平皿制成平板，培养后观察。 快速测定法快速测定法 将噬菌体和对数期宿主细胞悬浮液与含有0.50.8琼脂培养基混合，加到无菌载玻片上摊平凝固，经数小时培养后在显微镜、解剖镜或扩大镜下以观察噬菌斑并计数。这种方法可以达到早期检查的目的，尤其适合于工业发酵过程中检查噬菌体侵蚀情况。 斑点实验法斑点实验法 将宿主细胞制成菌悬液，涂布与培养基平板上，45左右倒置培养与恒温箱中至平板表面不留有水膜为止。将不同稀释度的待测试样依次用接种环点于平板上，培养数小时之后，根据噬菌斑形成与否可初步判断试样中噬菌体的效价。噬菌体的检测方法从育种角度，优良的抗性菌株应同时具备有抗性和高产量的特性。噬菌体对宿主具

12、有严格的专一性，选育一个抗性菌株，只有相应的噬菌体才有效。由于噬菌体本身在传代中会发生突变，使原来的抗性菌株对噬菌体的新变种变成敏感菌。所以选育一个菌株不是一劳永逸，一成不变，而是要不断收集工厂周围环境中各种不同的噬菌体，然后针对这些噬菌体选育相应抗性菌株，才能保证生产正常稳定地进行。抗噬菌体的选育程序：抗噬菌体的选育程序专一性噬菌体专一性噬菌体获得和纯化获得和纯化高效价噬菌体高效价噬菌体原液制备原液制备菌株诱发突变菌株诱发突变分离在含有噬分离在含有噬菌体的平皿上菌体的平皿上挑取抗性菌落挑取抗性菌落和摇瓶筛选（和摇瓶筛选（+噬菌体）噬菌体）分离到含噬菌分离到含噬菌体的平皿上体的平皿上挑取抗性菌

13、落挑取抗性菌落抗性菌株的特抗性菌株的特性试验性试验1.专一性噬菌体获得和纯化需要相应专一性噬菌体作为选择因子去选育抗噬菌体菌株。具体做法：（1）挑取培养皿上的噬菌斑，移接到含有1蛋白胨培养液（pH=7.0）中培养（2）用重层法连续多次进行分离，一直到出现噬菌斑形状、大小基本一致。（说明对宿主专一性的噬菌体得到纯化）抗噬菌体的选育程序的具体操作2.高效价噬菌体原液的制备高效价噬菌体原液的制备操操作步骤：作步骤：已纯化的噬菌已纯化的噬菌体体培养培养78h处处于对数期于对数期敏感菌培养液敏感菌培养液含噬菌体的上清含噬菌体的上清液液处于对数期的宿处于对数期的宿主菌悬液主菌悬液高效价噬菌体原液高效价噬菌

14、体原液培养培养10h离心离心适适温培养至释放温培养至释放细细菌菌滤滤器器过过滤滤3.噬菌体原液效价测定方法：用含有1蛋白胨溶液作为稀释剂，按常规发稀释到10-710-8，采用重层琼脂法进行定量测定，重复35个平皿。 噬菌体原液的效价要求达到噬菌体原液的效价要求达到10101011U/mL效效价价=平均每平皿噬菌斑数平均每平皿噬菌斑数*稀释倍数稀释倍数/取样量取样量（mL）4.菌株诱发突变和分离与常规诱变育种相同。用理化因子处理宿主菌，以提高抗性突变体的频率。然后把悬浮液分离在含有噬菌体的平皿上，经培养后，如果出现菌落，注意挑选些生长速度与正常菌落相差无几的菌落移接到斜面培养，这些菌落可能具有不

15、程度的抗性。进一步复证抗噬菌体的能力。此后在噬菌体存在条件下还要通过液体培养，观察菌体生长及发酵产物积累情况。5.液液体摇瓶振荡培体摇瓶振荡培养养从平皿上经过初步筛选的抗性菌株，进一步在摇瓶中进行培养。在一定温度下，培养到对数期(若丝状菌，孢子萌发后长成菌丝体)，加入一定量高效(1010一1011Um1)噬菌体原液。继续培养、观察菌体消失，而后又重新再生。此时，将再生菌体移入到新的培养基中，继续培养到对数期，加入高效价噬菌体原液再培养。如此反复34次，然后分离在含有噬菌体的平皿上，挑取生长速度快单菌落移入斜面，并在斜面上滴加噬菌体原液，经培养后，观察滴加原液处菌苔生长情况。选取生长正常的菌苔，再进行摇瓶复筛。经观察和测定，选取生长正常酶活力或产物产量高的菌株，保存，供特性试验