GB∕T 40265-2021 酶免疫检测抗体检测通则

ICS07.080

CCSA40

中华人民共和国国家标准

GB/T40265—2021

酶免疫检测抗体检测通则

Generalrulesfordeterminationofenzymeimmunoassayantibodies

2021-05-21发布

2021-12-01实施

GB/T40265—2021

本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。

本文件起草卑位：中国计量大学、北京工商大学、中国测试技术研究院生物研究所、华南农业大学。本文件主要起草人：叶子弘、夏文强、马爱进、张雅芬、冯德建、雷洪涛、崔海峰、吴微、马丽侠。

酶免疫检测抗体检测通则

1范围

本文件规定了酶免疫检测抗体检测的一般要求、检测过程和结果表述。

本文件适用于酶免疫检测用抗体的检测控制。

本文件不适用于具有标记物的酶免疫检测用抗体的检测控制。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T25915.1洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

抗体antibody

免疫球蛋白immunoglobulin

机体免疫系统在抗原刺激下，由B细胞增殖分化为浆细胞后产生的一类能与相应抗原特异性结合并介导产生体液免疫效应的球蛋白。

3.2

抗原antigen

可以诱导生物体产生抗体的物质，能够被相应抗体识别并与之结合。

3.3

种属来源host

用于免疫制备抗体的动物物种或抗体恒定区的氨基酸序列与待分析抗体最相近的动物物种。

3.4

抗体类型antibodyisotype

根据抗体的结构和免疫原性不同，对抗体的分类。

注：抗体重链可分为五类。抗体轻链可分为k和X两类。抗体重链的种类决定了抗体类型.哺乳动物体内的抗体包括IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五种类型，分别对应抗体重链p、7、a、8、e。

3.5

效价titer

某种抗体识别特异性抗原所需的最低浓度。

注：抗体效价通常使用检测结果呈阳性时抗体的最高稀释度表示。

库七七标准下载

GB/T40265—2021

3.6

纯度purity

样品中目标抗体含量占总蛋白含量的百分率。

3.7

亲和力affinity

抗体与抗原间的结合强度的综合评价指标。

注：包括单克隆抗体亲和力与多克隆抗体亲和力。通常用解离常数尺。表示。数值越低表示抗体亲和力越好。

3.8

交叉反应crossreaction

抗体与目标分析物的结构类似物也能产生反应的现象。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DMSO:二甲基亚讽(Dimethylsulfoxide)

HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)

IgA:免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA)

IgD:免疫球蛋白D(ImmunoglobulinD)

IgE:免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE)

IgG:免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)

IgM:免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM)

IgY:免疫球蛋白Y(ImmunoglobulinY)

TMB：3，3'，5，5'_四甲基联苯胺(3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine)

5一般要求

5.1检测样品

5.1.1检测样品宜具备说明书或同功能资料。

5.1.2应在洁净环境下，使用洁净、干燥器具取样。样品应具有代表性。蛋白抗原、抗体等不稳定的样品，宜在低于8°C的低温下尽快完成取样，并于低温保存待用。

5.2实验室

5.2.1生物安全部分应符合GB19489中的相应要求。

5.2.2洁净区的悬浮粒子浓度应符合GB/T25915.1规定的ISO6级的要求。

5.2.3在处理废弃样品、试剂和容器之前，应保证试验操作人员和周围环境的安全。为了降低污染物的毒性，防止有毒物质的泄漏，应根据废弃物的性质，对其进行无害化处理。

5.3试剂材料

5.3.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为生化试剂或更高级别试剂，水为GB/T6682规定的一级水。

2

库七七标准下载

GB/T40265—2021

5.3.2使用的玻璃器具应为一级硬玻璃或经过钝化处理。

5.3.3使用的合成树脂器具应为聚丙烯或其他低吸附材料制作，不添加染料、填充物。

5.3.4使用的酶标板底部应具有亲水表面。

5.4检测指标

5.4.1酶免疫检测用单克隆抗体的检测指标应包括种属来源、抗体类型、纯度、浓度、效价、亲和力、交叉反应。

5.4.2酶免疫检测用多克隆抗体的检测指标应包括种属来源、浓度、效价、亲和力、交叉反应。6检测过程

6.1抗体种属来源

宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量肽谱法等方法检测抗体的种属来源。若使用间接酶联免疫吸附法见附录A。

6.2抗体类型

宜使用间接酶联免疫吸附法、免疫扩散法、蛋白质免疫印迹法、化学发光免疫测定法或蛋白质质量肽谱法等方法检测抗体类型。若使用间接酶联免疫吸附法见附录A。

6.3抗体纯度

宜使用液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法或毛细管电泳法等方法检测抗体的纯度。若使用高效液相色谱法见附录B。

6.4抗体浓度

宜使用比色法、紫外分光光度法、液相色谱法、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法或化学发光免疫测定法等方法检测抗体的浓度。若使用高效液相色谱法见附录C。

6.5抗体效价

宜使用间接酶联免疫吸附法或试管凝集试验等方法检测抗体的效价。若使用间接酶联免疫吸附法见附录D。

6.6抗体亲和力

宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测抗体与目标分析物的亲和力。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录E。

6.7抗体交叉反应

宜使用竞争酶联免疫吸附法、表面等离子体共振法、生物膜层干涉法或等温滴定量热法等方法检测抗体与目标分析物结构类似物的交叉反应。若使用竞争酶联免疫吸附法见附录F。

3

库七七标准下载

GB/T40265—2021

7结果表述

7.1检测结果应包含样品的检测项目、试验样品信息、抽样信息及检测结论。

7.2单克隆抗体的检测结论应包括种属来源、抗体类型、纯度、浓度、效价、亲和力、交叉反应，并注明采用的检测方法。

7.3多克隆抗体的检测结论应包括种属来源、浓度、效价、亲和力、交叉反应，并注明采用的检测方法。

附录A

（资料性）

抗体种属来源和抗体类型检测间接酶联免疫吸附法

A.1原理

该方法使用可以识别不同种属来源和抗体类型的特异性抗体检测待测抗体的种类。根据待检测抗体的种属来源和抗体类型选择合适的HRP标记的特异性抗体若干，用于鉴定的抗体宜至少包括：抗小鼠IgG抗体、抗小鼠IgM抗体、抗兔IgG抗体、抗大鼠IgG抗体、抗山羊IgG抗体、抗仓鼠IgG抗体、抗绵羊IgG抗体、抗鸡IgY抗体。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。

在试验前，将除抗体、抗原母液以外的所有试剂恢复到室温。抗体、抗原母液融化后立即置于冰上。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。

A.2试剂与材料

A.2.1磷酸盐缓冲液（pH=7.2〜7.4）:在800mL水中加人1.15g磷酸氢二钠,0.20g磷酸二氢钾，0.20g氯化钾，8.00g氯化钠，溶解后，加水定容至1000mL。

A.2.2碳酸盐缓冲液（pH=9.6）:在800mL水中加人1.59g碳酸钠（无水）,2.93g碳酸氢钠，溶解后，加水定容至1000mL。

A.2.3封闭缓冲液：部分抗体可能与封闭液中的成分结合，影响检测结果。可根据实际情况选择以下封闭液配方：

——配方1:称取6.00g牛血清白蛋白，加磷酸盐缓冲液（pH=7.2〜7.4）定容至200mL,4°C保存。一配方2:在160mL水中加人2.00g酪蛋白,1.10g氢氧化钠，37°0磁力搅拌至完全溶解。然后加人0.23g磷酸氢二钠,0.04g磷酸二氢钾,0.04g氯化钾，用盐酸调节pH值至7.2〜7.4,加水定容至200mL，4°C保存。

A.2.4洗涤缓冲液：在1000mL磷酸盐缓冲液（pH=7.2〜7.4）中加人0.5mL吐温一20。

A.2.5抗体稀释液：在100mL封闭缓冲液中加人0.05mL吐温一20,4°C保存。

A.2.6TMB显色工作液：根据以下配方，按照1:1比例混合TMB显色液A与TMB显色液B即成，现配现用。

一TMB储存液:在80mLDMSO中加人1.00gTMB,溶解后，加DMSO定容至100mL,—20°（2避光保存。

-一TMB显色液A:在400mL水中加人0.20g乙二胺四乙酸二钠,0.95g拧檬酸，50mL甘油，20mLTMB储存液，溶解后，加水定容至500mL，4°C避光保存。

—TMB显色液B:在400mL水中加人13.60g三水合乙酸钠,1.60g拧檬酸，0.3mL过氧化氢（30%）,溶解后，加水定容至500mL，4°C避光保存。

A.2.7反应终止液：在800mL水中加人83.33mL浓盐酸，加水定容至1000mL。

A.2.8HRP标记的特异性抗体。

A.2.9酶标板（宜使用表面亲水的高吸附酶标板）。

A.3操作步骤

A.3.1包被:将抗原稀释至合适的浓度.一般为10Mg/mL~20yg/mL.稀释液为碳酸盐缓冲液（pH=9.6）。酶标板每孔加人100 稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4°C下孵育过夜。

A.3.2清洗:弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入200 洗涤缓冲液，室温静

5

库七七标准下载

GB/T40265—2021

置3mm后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次〜5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300Ml、洗涤缓冲液，重复5次。

A.3.3封闭：每孔加人200封闭缓冲液，在37°C恒温培养箱中孵育90min。

A.3.4清洗：重复步骤A.3.2。

A.3.5待测抗体孵育:将待测抗体按1:1000比例稀释，稀释液为抗体稀释液。每孔加人100稀释后的待测抗体样品。在37°C恒温培养箱中孵育60min。

A.3.6清洗：重复步骤A.3.2。

A.3.7特异性抗体孵育：根据说明书稀释各种HRP标记的识别不同种属来源和抗体类型的抗体，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100[iL稀释后的抗体，每种二抗重复3次。每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的抗体稀释液，重复3次。在37°C恒温培养箱中孵育60min。

A.3.8清洗：重复步骤A.3.2。

A.3.9显色：每孔加人IOOmLTMB显色工作液。在37°C恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束后每孔立即加人100mL反应终止液。

A.3.10测量：反应终止后30min内，在酶标仪上测量并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为

450nm，参比波长为620nm。

A.4结果分析

A.4.1试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于0.2,且最大测量结果的吸光度大于或等于0.8时.试验成立。反之，应重做试验。

A.4.2结果分析:按照式（A.1）计算针对不同种属来源和抗体类型的抗体的相对显色强度。

式中：

Sx—针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的相对显色强度；

ODX—针对某种种属来源和抗体类型的特异性抗体的吸光度测量值；

ODnc—阴性对照的吸光度测量值；

ODmax——所有测量结果中的最大吸光度。

当仅有一种特异性抗体的相对显色强度为1,且其他的相对显色强度均小于或等于0.4时，可以判定待测抗体的种属来源和抗体类型为相对显色强度为1的特异性抗体所识别的种属来源和抗体类型。否则，无法判断待测抗体的种属来源和抗体类型，如有需要，可通过抗体氨基酸测序和序列分析对抗体的种属来源和抗体类型进行判断。

附录B

（资料性）

抗体纯度检测高效液相色谱法

B.1原理

使用高效液相色谱法检测单克隆抗体的纯度时.可通过体积排阻或离子交换等不同原理对样品中的不同组分进行分离。

B.2检测方法

B.2.1待测样品：使用流动相A适当稀释待测抗体。

B.2.2液相色谱参考条件：

a） 色谱柱：体积排阻色谱柱，300mmX4mm（内径），填料粒径5f/m，孔径300A或性能相当者;

b） 柱温：25°C；

c） 流动相A：300mmol/L氯化|内，50mmol/L磷酸钠盐,pH=6.8的水溶液；

d） 流速：0.2mL/min；

e） 进样量：50f/L;

f） 洗脱程序=100%流动相A等度洗脱。

B.2.3紫外分光检测参考条件：

a） 检测波长：280nm；

b） 检测频率：10Hz。

B.3结果分析

分析目标抗体峰及其他峰的峰面积，通过面积归一化法计算抗体的纯度。

7

库七七标准下载

GB/T40265—2021

附录C

（资料性）

抗体浓度检测高效液相色谱法

C.1原理

利用蛋白ACProteinA）、蛋白G（ProteinG）等蛋白可以特异性识别并结合抗体Fc区域的特点，通过亲和层析检测样品中抗体的浓度。

C.2检测方法

C.2.1待测样品：使用流动相A适当稀释待测抗体。

C.2.2标准样品：使用流动相A将免疫球蛋白标准物质逐级稀释，得到抗体质量浓度为20mg/L、50mg/L、100mg/L.200mg/L、500mg/L、l000mg/L的系列标准工作液，质量浓度由低到高进行检测，以峰面积对质量浓度作图，做出标准曲线回归方程。

C.2.3液相色谱参考条件：

a） 色谱柱:蛋白A（ProteinA）亲和层析色谱柱，35mmX4mm（内径），填料粒径12ptm或性能相当者；

b） 柱温：25°C;

c） 流动相A：150mmol/L氯化钠，50mmol/L磷酸钠盐,pH=7.5的水溶液；

d） 流动相B：150mmol/L氯化钠，50mmol/L磷酸钠盐,pH=2.5的水溶液；

e） 流速：1.0mL/min；

f） 进样量：50fiL;

g） 梯度洗脱程序见表C.l。

表C.1梯度洗脱程序（亲和层析）

时间

min

流动相A

%

流动相B

%

一3.0

100

0

0.0

100

0

0.8

100

0

1.0

0

100

3.0

0

100

C.2.4紫外分光检测参考条件：

a） 检测波长：280nm；

b） 检测频率:10Hzo

C.3结果分析

使用外标法计算测试液及待测样品中抗体的浓度。样品溶液中抗体的响应值应在标准曲线的线性范围内，若超过线性范围则应稀释后再进行检测。

8

库七七标准下载

GB/T40265—2021

附录D

（资料性）

抗体效价检测间接酶联免疫吸附法

D.1原理

使用间接酶联免疫吸附法检测抗体效价。抗体梯度稀释的比例宜为1=2,抗体最终稀释度可根据实际情况进行调整。抗原包被浓度可根据实际情况适当修改。

在试验前，将除抗体、抗原母液以外的所有试剂恢复到室温。抗体、抗原母液融化后立即置于冰上。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标板并拆除多余的酶标板条块后待用。

D.2试剂与材料

所需试剂与材料见A.2。

D.3操作步骤

D.3.1包被：将抗原稀释至合适的浓度.一般为10Mg/mL〜20Mg/mL.稀释液为碳酸盐缓冲液（pH=9.6）。酶标板每孔加入100Ml、稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4°C下孵育过夜。

D.3.2清洗:弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加入200ML洗涤缓冲液，室温静置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次〜5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300 洗涤缓冲液，重复5次。

D.3.3封闭：每孔加人200封闭缓冲液，在37°C恒温培养箱中孵育90mm。

D.3.4清洗：重复步骤D.3.2。

D.3.5一抗孵育：准备一系列倍比稀释的待测抗体，初始的稀释浓度一般为1:1000,稀释液为抗体稀释液。每孔加入100稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复3次。每次试验设置空白对照，空白对照为不含有抗体的抗体稀释液，重复6次。在37°C恒温培养箱中孵育60min。

D.3.6清洗：重复步骤D.3.2。

D.3.7二抗孵育：根据二抗说明书稀释HRP标记的二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加人100yL稀释后的二抗。在37°C恒温培养箱中孵育60mm。

D.3.8清洗：重复步骤D.3.2。

D.3.9显色：每孔加入100TMB显色工作液。在37°0恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束后每孔立即加入100ptL反应终止液。

D.3.10测量：反应终止后30min内，在酶标仪上测量并记录各个孔的吸光度。检测波长为450nm,参比波长为620nm。

D.4结果分析

D.4.1试验成立判定：当空白对照的吸光度小于或等于0.2时，试验成立。反之，应重做试验。

D.4.2试验结果分析：当空白对照的吸光度小于或等于0.05时.按照0.05进行效价分析；当空白对照的吸光度大于0.05,并且小于或等于0.2时，按照实际测量结果进行效价分析。

D.4.3当样品的吸光度大于或等于空白对照的吸光度的2倍时认定为阳性。结果为阳性的待测抗体的最高稀释度为待测抗体的效价。

9

库七七标准下载

GB/T40265—2021

附录E

（资料性）

抗体亲和力检测竞争酶联免疫吸附法

E.1原理

使用竞争酶联免疫吸附法检测抗体亲和力时，首先让溶液中的抗原与溶液中的抗体充分结合并达到解离平衡，然后将溶液转移至底部包被有相同抗原的酶标板中。酶标板底部的抗原与溶液中游离的抗体结合，从而分析溶液中游离抗体的含量，计算抗体与抗原间的解离常数。

分析过程中，酶标板底部抗原与溶液中游离抗体的结合将影响溶液中原有的抗原-抗体解离平衡，干扰检测结果。因此酶标板上包被的抗原量应尽可能低，但同时不影响观测。竞争酶联免疫吸附法检测抗体亲和力通常分为两步，第一步明确酶标板上包被抗原的合适的量，第二步对亲和力进行分析。

E.2试剂与材料

所需试剂与材料见A.2。

E.3操作步骤

E.3.1选择合适的抗原包被浓度及抗体稀释倍数

E.3.1.1包被:将抗原稀释至1fxg/mL，稀释液为碳酸盐缓冲液（pH-9.6）。酶标板每孔加100稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4°C下孵育过夜。

E.3.1.2清洗:弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加人200洗涤缓冲液，室温静置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次〜5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300mL洗涤缓冲液，重复5次。

E.3.1.3封闭：每孔加人200 封闭缓冲液，在37°C恒温培养箱中孵育90min。

E.3.1.4清洗：重复步骤E.3.1.2。清洗结束后将部分酶标板条块拆下并安装在第2个架子上，每孔加入200ij-L洗涤缓冲液后，4°C储存备用。其余的酶标板条块用于E.3.1.5。

E.3.1.5第1块酶标板加样：准备一系列倍比稀释的待测抗体，稀释液为磷酸盐缓冲液（pH=7.2〜7.4），初始的稀释度一般为1:1000。每孔加人100mL稀释后的待测抗体样品，每个浓度重复3次。每次试验设置空白对照，空d对照为不含有抗体的磷酸盐缓冲液（PH=7.2〜7.4），重复3次。在37°C恒温培养箱中孵育30mm。

E.3.1.6第2块酶标板加样：将第1块酶标板中的液体小心吸出，每个浓度的3次重复混合为1管（略少于300jzL）。取出E.3.1.4中备用的酶标板条块，将从第1块酶标板吸出的液体加人第2块酶标板中，每孔加人100pcL样品，每个浓度重复2次。在37°C恒温培养箱中孵育30min。

E.3.1.7第1块酶标板清洗:按照E.3.1.2清洗第1块酶标板。

E.3.1.8第1块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释HRP标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加人100pi稀释后的二抗。在37°C恒温培养箱中孵育60min。

E.3.1.9酶标板清洗:按照E.3.1.2清洗第1、2块酶标板。

E.3.1.10第2块酶标板二抗孵育：根据说明书稀释HRP标记的相应二抗，稀释液为抗体稀释液。每孔加入100ML稀释后的二抗。在37°C恒温培养箱中孵育60min。

10

库七七标准下载

GB/T40265—2021

E.3.1.11第1块酶标板显色与测量：每孔加人100TMB显色工作液。在37°C恒温培养箱中避光孵育30min。反应结束后立即每孔加入100反应终止液。反应结束后30min内，在酶标仪上测量并记录样品和空白对照的吸光度。检测波长为450nm.参比波长为620nm。

E.3.1.12第2块酶标板清洗:按照E.3.1.2清洗第2块酶标板。

E.3.1.13第2块酶标板显色与测量：同E.3.1.11。

E.3.1.14浓度评价：取两块酶标板中处于线性范围内的测量结果，通过线性回归分析抗体稀释度与显色强度的关系。如果两块酶标板的线性回归的斜率相差10%以内，说明该包被浓度和试验条件适合进行抗体亲和力检测，处于线性范围内的抗体最高浓度适合用于抗体亲和力检测。如果第2块酶标板的显色强度大幅度降低，说明抗原包被浓度过高，应将抗原包被浓度降低至1/5〜1/10后重新进行以上试验，直至获得合适的包被浓度。

E.3.2亲和力检测

E.3.2.1抗原包被:将抗原稀释至E.3.1中判断合适的浓度，稀释液为碳酸盐缓冲液（pH=9.6）。每孔加人100yL稀释后的抗原，用合适的塑料制品覆盖酶标板并在4°C下孵育过夜。

E.3.2.2清洗：弃去酶标板中的液体，在吸水纸上轻轻拍干。然后每孔加人200洗涤缓冲液，室温静置3min后弃去酶标板中的液体，并在吸水纸上轻轻拍干，重复3次〜5次。或使用微孔板自动洗板机进行清洗，每次使用300ML洗涤缓冲液，重复5次。

E.3.2.3封闭：每孔加人200f/L封闭缓冲液，在37°C恒温培养箱中孵育90min。

E.3.2.4清洗:重复步骤E.3.2.2,4°C保存备用。

E.3.2.5样品准备:将待测抗体样品稀释至E.3.1中判断处于线性范围的最高抗体浓度的2倍，稀释液为磷酸盐缓冲液（PH=7.2〜7.4）。准备一系列倍比稀释的抗原，稀释液为磷酸盐缓冲液（pH=7.2〜

7.4），抗原的初始浓度一般为1fzmol/L。

E.3.2.6抗原-抗体结合:分别将200mL稀释后的待测抗体样品与200yL不同浓度的抗原在新的离心管中混合。每次试验设置空白对照，空白对照为在200M