实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2

1、实验一、碱裂解法抽提质粒实验一、碱裂解法抽提质粒DNA质粒质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。本实验以碱裂解法碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用；、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用；2、掌握常用分子生物学试剂的配制；、掌握常用分子生物学试剂的配制；3、掌握无菌操作技术；、掌握无菌操作技术；4、掌握大肠杆菌的培养、保存

2、及液体培养物、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法；值测定的方法；5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；6、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。、学会根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。一、实验目的一、实验目的在在 pH 12.012.6 碱性碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，变性分开，而共价闭环的质粒而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将将 pH 调至调至中性中性并有并有高盐高盐存在及存在及

3、低温低温的条件下，大部分染色体的条件下，大部分染色体 DNA 、大分、大分子量的子量的 RNA 和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然仍然为可溶状态。为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。二、实验原理二、实验原理1 1、 含有含有pBluescript II SK (+)(pSK)(pSK)质粒载体的大肠杆菌菌株质粒载体的

4、大肠杆菌菌株DH5菌液菌液2 2、含有重组质粒、含有重组质粒 MP3MP3的大肠杆菌菌株的大肠杆菌菌株DH5菌液菌液注：注：pBluescriptpBluescript是由是由StratageneStratagene公司开发的噬菌粒载体（公司开发的噬菌粒载体（phagemid vectorphagemid vector，由质，由质粒载体和单链噬菌体的复制起点结合而成）。粒载体和单链噬菌体的复制起点结合而成）。重组质粒重组质粒MP3MP3是利用是利用Hind III对对水稻基因组水稻基因组DNADNA进行进行部分酶切（不完全酶切）部分酶切（不完全酶切），然后，然后与与Hind III酶切的酶切的

5、pSK（长约（长约3kb）连接筛选得到的重组质粒，插入的）连接筛选得到的重组质粒，插入的水稻基因组水稻基因组DNADNA片段长约片段长约3kb3kb。三、实验材料三、实验材料分子生物学常用的大肠杆菌（分子生物学常用的大肠杆菌（E. coli）菌株：）菌株：DH5：是世界上最常用的生物工程菌株之一，特别是在克隆应用方面；其主要特点是 ：高转化率、高稳定性、遗传标记多；是扩增菌，可使质粒高拷贝数扩增。DH10B：was designed for the propagation of large insert DNA library clones. It is used extensively, t

6、aking advantage of properties such as high DNA transformation efficiency and maintenance of large plasmids.BL21：是表达菌，利于蛋白的表达。该质粒载体用的是该质粒载体用的是pUC的复制子，拷的复制子，拷贝数能达到贝数能达到500-700个。个。四、仪器设备四、仪器设备五、实验用具五、实验用具高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床 恒温培养箱 干燥箱 台式离心机（冷冻式或非冷冻式）台式离心机（冷冻式或非冷冻式） 旋涡振荡器培养用试管 量筒 冰盒 微量离心管 移液器移液器 吸管头若干六、试剂六、

7、试剂细菌培养用试剂细菌培养用试剂细菌裂解用试剂细菌裂解用试剂质质粒粒提提取取用用试试剂剂核酸沉淀、纯化、溶解用试剂核酸沉淀、纯化、溶解用试剂注：配制时要把试剂粉末加入到水里，把注：配制时要把试剂粉末加入到水里，把水加到试剂里会造成结晶难溶。水加到试剂里会造成结晶难溶。七、实验步骤七、实验步骤（一）细菌的培养（一）细菌的培养（二）菌体的收集和裂解（二）菌体的收集和裂解（三）分离与纯化质粒（三）分离与纯化质粒DNA1、取超低温与干有种保存的含有质粒的大肠杆菌菌液于固体 LB培养基上 划线，37 倒置过夜培养至长出单菌落；2、用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37

8、 摇床，200 r/min 过夜培养。（一）细菌的培养（一）细菌的培养3、吸取 1.5 ml 菌液， 12000 rpm 离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；若菌体沉淀少，重复以上步骤再次收集菌体，尽量将菌液倒干净尽量将菌液倒干净；4、加入 300 l 溶液 I + 5 l RNaseA （10 mg/ml）振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块应彻底打匀沉淀或碎块），静置2分钟；5、加入 250 l 溶液 II ，轻柔颠倒轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过放置至清亮，一般不超过 5 分钟分钟；6、加入 180 l 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分

9、沉淀；7、12000 rpm离心10 分钟；（二）菌体的收集和裂解（二）菌体的收集和裂解8、吸取 约500-600 l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质，若有杂质，则上清12000 rpm离心5分钟后吸取上清）至另一 Eppendorf 管中；（记体积）（记体积）9、加入 2/3 体积的酚/氯仿上下颠倒抽提10分钟，室温下静置待分层后12000 rpm 离心 10分钟；（含有酚和氯仿的管子要盖好放于通风橱中）（含有酚和氯仿的管子要盖好放于通风橱中）10、移取上清液（记体积），加2倍体积冷的冷的无水乙醇无水乙醇（ -20 冰箱），冰箱），混匀；11、离心（12000 rpm，10分钟，室温)，

10、倒掉乙醇。离心几秒钟，用移液器尽可能尽可能除去除去乙醇乙醇；12、加入0.5 ml 70乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉乙醇；13、加40 l 1 TE 溶解，于65热板上温育10分钟，之后于 -20 保存备用。（若溶液若溶液I中不加中不加RNaseA，则加入，则加入 2 l RNaseA于于37 恒温箱中温育恒温箱中温育3030分钟分钟消化残留的消化残留的RNARNA）（三）分离质粒（三）分离质粒DNA1、每小组合并所提的两管相同质粒，加入1 TE或者ddH2O调整DNA溶液为300 l，加入300 l 酚/氯仿，充分振荡充分振荡抽提抽提5-10 min。（去蛋白）（去蛋白）2、离心（

11、12000 rpm，5分钟），吸取上清液（注意不要触碰到中间杂质和下层的（注意不要触碰到中间杂质和下层的有机相，吸上清记体积最好用有机相，吸上清记体积最好用200 l移液器）移液器）。3、加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇预冷无水乙醇，混匀。4、置于-70oC冰箱约10分钟以上或-20oC冰箱30分钟至数小时。（DNA沉淀）沉淀）5、离心（12000 rpm，15分钟，4oC），倒掉乙醇，离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇（为了尽可能减少杂质残留）（为了尽可能减少杂质残留）。6、用0.5 ml 70乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉乙醇。（去除（去除DNA中的中的

12、盐离子）盐离子） 7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。8、根据DNA沉淀的大小加2050 l 1 TE 溶解DNA沉淀，并在65热板上温育10分钟（可使可使DNaseDNase失活失活），之后于 -20 保存备用。 （三）纯化质粒（三）纯化质粒DNA质粒抽提方法即去除去除 RNA，将质粒与细菌基因组细菌基因组 DNA分开分开，去除蛋白质及去除蛋白质及其它杂质其它杂质，以得到相对纯净的质粒。使用相对过量的试剂使用相对过量的试剂 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！详情请参考：详

13、情请参考：http:/ kb）。注意事项注意事项1、因为细菌培养液中的细胞壁成分抑制限制性内切酶活性，所有未从细菌沉淀中除去所有培养液可导致质粒不能被限制性内切酶切割或不能完全切割。2、酚：酚：在酸性pH条件下，DNA分配于有机相。因此，使用前酚必须用水饱和并用Tris平衡至 pH7.8，以防DNA分配到有机相。3、乙醇沉淀：乙醇沉淀：是从水溶液中回收核酸的标准方法。乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此，只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。思考题（质粒抽提）思考题（质粒抽提）1、为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？2、异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点。3、划线培养好的平板和培养好的菌液如何短暂存放？4、抽提质粒一般用1TE溶解，TE的成分是什么？各成分有什么作用？5、加3M NaAc及无水乙醇（或异丙醇）沉淀DNA的原理是什么？6、