DNA测序与基因芯片

1、DNA测序与基因芯片一、背景介绍20世纪70年代，弗雷德桑格尔(Frederick Sange)发明基因测序技术，并因此获 得诺贝尔奖。1990年10月，在全球范围内引起巨大反响的“人类基因组计 划(Human genome project, HGP)正式启动、至2003年，中、美、日、德、法、 英等6国科学家联合宣布人类基因组序列图绘制成功，历时13年，耗资额近30亿 美元。基因组计划是人类为了探索自身奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿 波罗登月计划之后，人类科学史上的又一伟大工程。就像了解人类身体构造对于目 前医学发展的贡献，对人类基因组的了解对医学和其他健康科学提供必不可少的支 持

2、，可以达到从根本上认识生命的起源、种间、个体间的差异 的原因，疾病产生的 机制，以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象。此后，基因测序技术突飞猛进，测序时间明显缩短，且成本也有大幅下降。但 是，随着越来越多的基因组序列得以测定，基因序列数据也正以前所未有的速 度迅速 增长。建立一种方法去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能，就大量的遗传 信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要，而基因芯片的出现为解决此类 问题提供了光辉的前景。基因测序和基因芯片是两种重要的基因组学研究方法，是解开包括癌症在内的 很多疾病与基因之间紧密联系必不可少的工具，在生命科学研究领域有着极其广泛的 应用前景

3、二、主要技术路线1. 基因测序测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了矣于 早 期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核昔酸序列。直至 1977年San ger等发明的双脫氧核昔酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测 序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩 增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。最近，Helicos公司的单分子测序技 术和OxfordNanopare Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为

4、是 第三代测序技术。测序技术正向着高通量、彳氐成本、长读取长度的方向发展。(1) 第一代测序技术San ger测序法，又称末端终止法测序技术，其基本原理是利用一种 DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核背酸为止。每一 次序列测定由一套四个独立的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核昔酸三磷酸 (dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核昔三磷酸(ddNTP) o由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延长的寡聚核昔酸选择性的在四种脫氧核昔 酸三磷酸(G、A、T或C)处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应

5、得到一组长几至几千碱基 的链终止 物。它们有共同的起点，但是终止在不同的核昔酸上，因此长度各有不同，通过凝 胶电泳将这些DNA片段进行分离，同时借助自显影、非同位素标记或其它方法等进 行检测。Sanger测序法经历了从最初的手工测序到半自动化、全自动化的发展。目前， 最先进的一代测序设备是Applied Biosystem 3730XL测序仪。它采用毛细管电泳代 替平板电泳分离技术，可以提供高质量、高通量的片段读取和序列分析，应用灵活 而广泛，同时可分析96或384个样品，不间断24小时运行，自动灌胶、上样、电 泳分离、检测及数据分析。如今，测定每千个碱基序列的成本是0.5美元，每天的 数据通

6、量可以达到600000个碱基，原始数据的准确率可以高达99.999%。然而，由于其对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已 达到了极限，使其很难有进一步提升分析速度和提高并行化程度的空间，并且很难 通过微型化降低测序成本。因此，需要开发全新的技术来突破这些局限。尽管如 此，第一代测序技术不会很快消失，它将于新的若干测序平台并存。其久经考验的 方法可靠、准确，且已形成规模化，特别是在PCR产物测序、质粒和细菌人工染色 体的末端测序、以及STR基因分型方面，将继续发挥重要作用。(2) 第二代测序技术第二代测序技术作为对传统测序一次革命性的改变，是最近几年建立的高通量 技术，其特点是

7、一次测序反应可以产生千万到亿万条序列，而测序的成本大大降低， 因此又称下一次测序技术(Next Gen eration Seque nee NGS)。所有下一代测序平 台的核心思想都是边合成边测序(Sequencing by Synthesis 即通过捕捉新合成的 末端的标记来确定DNA序列。目前为止，3种广泛使用的商业化平台技术是Roche 公司的454 FLX技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司 的SOLID技术。它们 基本都是在20世纪90年代末被发明和开发出来，在2005年前后商业化，通过几 年的发展，每平台都有不同程度的升级。这三个技术平台各有优点，454 FLX

8、 的测序片段比较长，高质量的读长能达到400bp ； Solexa测序性价比最高，不仅机 器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有 454测序的1/10 ； SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%， 而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最 高的。但是，所有的这些平台都遵循了类似的工作流程，尽管从模板文库制备、片 段扩增到测序，这些方法所采用的技术与生物 化学相当多样，但是都采用了大规模矩 阵结构的微阵列分析技术，阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。首先，构建DNA模板库。通过随机打断基因组DNA获

9、得长度为数十到数百碱 基的的DNA文库片段，或者构建控制距离分布的配对末端片段。接着，在双链片段 的两端连上接头序列，然后变性得到单链模板文库，并固定在固体表面 上，固体表 面可以是平面或是微球的表面。克隆的扩增通过以下几种方式之一进 行，如桥式 PCR、微乳滴PCR或原位成簇。随后，对在芯片上的DNA簇或扩增微球，利用聚 合酶或者连接酶进行一系列循环的反应操作，通过显微检测系统监控每个循环生化反 应中产生的光学事件，用CCD相机将图像采集并记录下来，对产生的阵列图像进行 时序分析，获得DNA片段的序列。最后，按照一定的计算机方法将这些片段组装成 更长的重叠群。在一般性描述中，下一代测序技术的

10、特点显而易见：第一，通过有序或者无序 的阵列配置可以实现大规模的并行化，以提供高程度的信息密度。不同的测序平台 一次实验可以读取40万到400万条序列，读取长度从25bp到450bp,读取 的碱基数 从1G到14G不等，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。第二，不采用 电泳，设备易于微型化。相对于第一代测序技术，第二代测序的样 本和试剂消耗量得 以降低，但是第二代测序仪的推广可能因为其价格昂贵有些困难，只有当实验室的测 序工作量非常大时才会考虑购买。目前，一些模式生物的全基因组测序、非模式生物 的全基因组测序以及一些生物的转录组测序都采用了第二代测序技术。(3) 第三代测序技术尽管第二

11、代测序技术已显示出巨大的潜力，但是因为科学的不断进步，在给测 序技术提出新的要求时，也给这项技术带来了新的增长点。2008年4月HelicoBioScienee公司的Timothy等人在Scienee上报道了他们开发的真正的单分 子 测序技术，也被成为第三代测序技术。这项技术完全跨过了第二代测序技术依赖基 于PCR扩增的信号放大过程，真正达到了读取单个荧光分子的能力，向100美元测定 一个人类基因组的目标迈进了一大步。第三代测序技术实现了 DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱 基，测序速度是化学法测序的2万倍；它还实现了 DNA酶内在的延续性，一次反应 就可以测长达几千个碱基的序

12、列，这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条 件；而其还有两个应用是第二代测序所不具备的，即可以直接测RNA的序列和可以 直接测甲基化的DNA序列。目前来看，这种第三代测序仪将主要用于使用第一和第二代测序仪无法解决的人 类基因组片段的测序以及表观遗传学研究领域。在不远的将来，如果他们能和二代 测序一样集成100万个纳米微孔，那么一台仪器15分钟就能够准确地测出一个人的 基因组。2. 基因芯片基因芯片(Gene Chip)的原型是80年代中期提出的，系指将大量探针分子固定 于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进 而获取样品分子的数量和序列信息。它将生命科学研

13、究中所涉及的不连 续的分析过程 (如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算 机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型 化。该技术的发展直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合 以及激光共聚焦显微技术的引入，它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切 实可行，而且可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确 的检测和分析，因此又称 DNA 微阵列(DNA Microarray )。基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子 反应和信号的检测。目前DNA探针列阵的构建方法主要有两种策略：即直接在

14、芯片 上进行的寡聚核昔酸探针原位合成(In Situ Synthesis)和芯片外(Off-chip)的探针合成两种方法，通过这些方法可以将寡聚核昔酸或短肽固定 到诸如 玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等经过特殊处理的固相支持物上。 然后将待测样品用荧光或其它方法标记后作为靶分子与基因芯片上的探针阵列杂交， 由于在基因芯片阵列中某一特定位置上的核昔酸序列是已知的，所以对微阵列每一位 点的信号进行检测，即可对样品的遗传信息进行定性定量分 析。而检测和分析测定方 法主要为荧光法，其重复性好，不足之处是灵敏度仍较低。同时，质谱法、化学发 光法、光导纤维法也正在逐步发展。罗氏(Roche)

15、、安捷伦(Agile nt )、昂飞(Affymetrix )、lllumi na等多家公司都针 对不同的研究需求推出了多种芯片，包括了表达谱芯片、SNP芯片、比较基因组杂交(CGH)芯片、microRNA芯片、DNA甲基化芯片、染色质免疫共 沉淀 (Chip-o n-chip)芯片等各种基因芯片产品998年底美国科学促进会将基因芯片技术 列为年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。在实际应用方面，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之 中，包括疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫 生监 督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命

16、的起源、遗传、发育 与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设 计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。在疾 病诊断方面，与传统的检测方法相比，它可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多 种疾病的检测，还可以从分子水平上了解疾病，使医务人员能在短时间内掌握大量 的疾病诊断信息，找到正确的治疗措施，指导临床用药。三、应用领域将测序技术与生物芯片技术相结合，使其成为广泛使用的常规实验手段，可以 协助广大科研工作者以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋 白质组的各项数据，快速和准确地获取生物体的遗传信息，这对于生命科学 的研究

17、 具有十分重要的意义。1-疾病研究与诊断大多数人类常见疾病，如糖尿病、高血压、冠心病、银屑病、精神 分裂症、阿兹海默症等，因具有患病率高，发病机理复杂，难以治愈等特点，也只是 困扰 医学界的难题。这些疾病都是由多个微效基因的累加效应结合环境因素共同作用 所导致，也被成为多基因遗传病。对于这类疾病的研究主要集中在寻找和定位疾 病易 感基因方面。例如，利用全基因组尖联分析(Genome-Wide Association Studies,， GWAS )，通过分析标签单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)检测人类基因组中大多数常见的SNPs,识别

18、人类基因组中可 能与复杂疾病相尖联的变异。这种方法最近几年在人类医学领域中发展迅速，在过去 五年中，研究人员利用GWAS对100多种复杂疾病和性状进行了研究，发现了大批易 感基因和位点。此外,利用基因芯片技术还可以对疾病做出快速、简便、高效、准确地分析而得 出病变信息：DNA突变发生在什么位点？属于什么类型的序列突变？基因表达是否 有异常？得出正确的诊断之后，即可根据病变的靶序列或靶蛋白设计相应的药物，以 改变靶序列的表达情况从而达到治疗疾病的目的。目前基因芯片在感染性疾病、遗 传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检 测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病

19、人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应 答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可 帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次(通常称之为，第二阶段医学？)” 转变到“DNARNA、蛋白质及其相互作用层次(第三阶段医学)”上了解疾病的发 生、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内可以掌握大量的疾病诊断信息， 这些信息有助于医生在短时间内找 到正确的治疗措施。例如，在人类所患肿瘤中，有 50%以上都是由P53基因突 变所致，目前Affymetric公司已研制出P53基因芯片， 用于肿瘤的早期诊断及肿 瘤易感性的判断。此外，尚有检验HIV的芯片及有无药物 代谢缺

20、乏症的CytP450芯片等。2.药物筛选同一物种不同种群和个体之间，有许多不同的基因型，这种不同与个体的不同 性状、多种遗传病都有着密切的尖系。通过对大量具有不同性状的个人基因型进行比 较，就可以得出基因与性状的尖系，而基因的多态性又与药物治疗有着密切的尖 系。为研究这些多态性差异，需要高通量、高灵敏度、高特异性且极为有效的差异检 测方法，而这正是基因芯片的特点。利用芯片技术的高通量、大规模、平行性等特点可以有效的帮助研究人员进 行 新药的筛选，甚至包括对我国传统中药有效成分的筛选。基因芯片对于药物靶标的 发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性 评价方 面都有其它方

21、法无可比拟的优越性，能够从基因水平解释药物的作用机理，可以用基 因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，国外几乎所有的主要 制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标查检药物的毒性或副作 用。例如，Kapp U等用包含950个基因探针的基因芯片比较何 杰金氏病细胞系 L428及KMH2与EB病的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达谱，发现何杰金氏病 源的细胞系中自细胞介素13( IL13)及白细胞介素一 5( IL-5)表达异常增高，用IL-13 抗体处理何杰金氏病源细胞系可显著抑制其增殖，此发 现提示IL-13可能以自分泌 形式促进何杰金氏相尖细胞增殖，IL13及其信号

22、传导途径可能成为何杰金氏病治疗及 药物筛选的新靶点。3 个性化给药不同病人对同一药物有不同的反应，一直是困扰临床医学人员的一个难题。例 如，临床上同样药物的剂量对病人甲可能有效，对病人乙不起作用，而对病人丙则 可能有副作用，在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。但现已明确，这 些差异是由基因多态性引起的，即药物反应的遗传多态性，可表现为药物代谢酶的 多态性、药物转运的多态性、药物受体及药物标靶的多态性等。这些多态性的存在 都有可能导致许多药疗中药物的药效和毒副作用的个体差异。例如细胞色素P450酶 与大约25%广泛使用的药物的代谢有尖，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药 异哇脈产生明

23、显的副作用，有研究表明5%10%的高加索人就缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与 易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有尖。如果利用基因芯片技术对患者 先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多 同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。利用基因芯片技术不仅可 以检测药物反应多态性的基因差异，同时还可“钓出”药物应答基因，在基因水平上 设计药物，避免病人服用低效、无效甚至有毒副作用的药物，使处方个性化，从而 结束单一处方的时代。例如现用于治疗AIDS的药物主要是病毒 逆转录酶RT和蛋白 酶PRO的抑

24、制剂，但在用药3-12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一 个或多个点突变。Rt基因有4个常见突变位点，4个位点均突变较单一位点突变后 对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯 片，则可快速地检测病人是哪些基因发生突变，从而对症下药，所以对指导治疗和预 后有很大的意义。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌 基因型，使得药品更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目 的。4.预防医学出生缺陷，也叫先天异常，先天畸形。它包含两个方面：一是指婴儿出生 前，在妈妈肚子里发育紊乱引起的形态、结构、功能、代谢、精神、

25、行为等方面的异 常；二是指婴儿出生后表现为肉眼可看见，或者辅助技术诊断的器质性、功能性 的 异常，如先天性心脏病、白血病、青光眼等。据统计，中国每年约有80万至120万 出生缺陷儿出生，占全部出生人口的4%到6%。而且多个省份统计显示，从2003 年开始，婴儿的出生缺陷率在不断上升。在随着卫生状况和生育医疗保健水平的提 高，婴儿死亡率呈下降趋势，而出生缺陷所造成的胎儿和婴儿死亡比重在逐渐增 加。出生缺陷已成为中国婴儿死亡的主要原因。出生缺陷不但能引起新生儿死亡， 即使能够存活，大部分新生儿都会留有残疾，严重地影响着将来的生活质量，同 时，给家庭造成的经济负担和精神痛苦是无法计算的。因此，中国政

26、府将9月12日 定为“中国预防出生缺陷日”。利用基因测序和基因芯片技术，在婴儿出生前，可用进行有效的产前筛查和诊 断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。而在婴儿出生后，即可分析其基因图谱，不仅 可预测出他日后可以长多高，还可预测其患某些疾病的潜在可能性有多大，以便采取 预防措施。总之，作为基因测序和基因芯片作为两个重要的基因组学研究技术，在应用 的 某些方面存在重叠和竞争，但是在更多方面是优势互补，两种方法联合使用，将解决 以前的单种技术难以解决的问题。例如目前新兴的序列捕获(SequenceCaptur)e技 术，就是结合了芯片和测序技术，利用芯片探针捕获待测片段，再用二代测序技术 分析核酸序列

27、，利用高密度芯片和454测序仪曾成功的 捕获了 6726个500碱基长 度的外显子和200kb到5Mb的DNA区段，测序结果 显示大多数的捕获DNA是符合 设计要求的目的片段，该实验验证了序列捕获的特异性和可行性，芯片的序列捕获技 术将来有可能在对基因组区段测序的研究中取代多重PCR过程。四、国内外形势分析 由于基因测序和芯片技术在医药领域的众多用途及其巨大 的商业发展前景，各国政府都投入了大量资金进行研究，使这些技术进展十分迅速并 取得了长足的进步。数据显示，全球生物产业销售额几乎每5年翻一番，增长速度 是世界经济平均增长率的近10倍。预计到2020年，生物医药占全球药品的比重将 超过1/3，而这些与基因测序和基因芯片技术都有着密不可分的尖系。近年来，我国也采取一系列措施加大对生物技术创新和生物产业发展的支持力 度，包括出台生物产业发展“十一五”规划，组织实施生