生物固氮的15N2同位素示踪直接测定方法ppt课件

1、生物固氮的15N2同位素示踪直接测定方法齐孟文中国农业大学; 用15N同位素测定生物固氮的方法可分为间接和直接两种方法，间接测定又包括15N富集同位素示踪法和用15N自然丰度变异法，该两种方法均需求参比作物或知参比值以确定生物的固氮量，因此普通有很大的不确定性，固氮量确实定只能是半定量的；直接测定法是将结合固氮系统暴露在15N2气气氛中，经过直接测定15N吸收同化而确定其固氮的方法，这种方法是一种定量测定生物固氮的方法，但需求将固氮系统封锁在一个气密的固氮暴露箱内，操作比较复杂，另外标志同位素破费较高，因此长期以来在研讨运用并不非常广泛，然而随着DNA或RNA探针技术的开展，直接固氮测定法在测

2、定固氮和确定固氮微生物的根底研讨方面将展现宽广的运用前景。; 1.15N2的制备、纯化和存储 15N2可由15N标志铵盐在碱性条件下和次溴酸盐反响制得，即 试剂 用Bremner法制备次溴酸盐一碘溶液。将400克NaOH溶解到60毫升水中，将此NaOH溶液的一半参与带有温度计并以碎冰冷却的一公升Ernlemeyer烧瓶中，将120毫升Br2缓慢地、逐滴地参与, 猛烈搅拌, 使温度坚持在5 以下，再参与另一半NaOH溶液，将此混合液搅拌几分钟，在冰箱中储存一个星期之后, 将沉淀的NaBr结晶与上清液分开，用等体积的KI溶液0.2%，w/v稀释上清液。1 毫升这种溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成

3、N2。 100毫升水中依次溶解5克KMn4和2.5克KOH, 制成KMNO4-KOH溶液，100毫升硫酸溶液 5%，v/v 中溶解20克NaSO4, 得到NaSO4H2SO4溶液。O2HBrN2OBrNH22215-415; 安装 制备安装如下图。各玻璃部分间是经过涂抹硅油的磨口接合并用耐压管道连结。图中Y和Z分别为KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2气储存瓶V与另一只瓶子W连结, 可以防止空气回流到V。选用大小不同的圆底烧瓶, 可以使X、Y 和Z部分的容积, 比试剂在一个大气压下产生的15N2 的总体积略微大一些，这时安装内部的气压应该小于大气压。; 步骤 在烧瓶X中

4、放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中参与相应数量的次嗅酸盐一碘溶液。在Y和Z中分别参与KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液, 约到其容积的1/10即可。用真空泵从处抽气, 使X的真空度到达大约10-2-10-3托，封锁活栓a ，然后翻开分液漏斗的活栓, 将次嗅酸盐一碘溶液滴入X中, 产生15N2气，在产气过程终了后， 将蒸馏水参与分液漏斗, 并使蒸馏水滴入烧瓶X中，当瓶中 15N2的压力稍大于大气压力时, 滴漏过程便自动停顿。; 翻开活塞b、c 、d、e 和f, 封锁活塞g, 从活塞f处对Y和Z抽真空, 封锁活塞c , 翻开活塞a , 小心地翻开活塞b 使X瓶中15N2的进入

5、Y,待分液漏斗中的水完全置换出X瓶中的15N2 气体后, 封锁活塞b。封锁活塞e并翻开活塞c, 从处放水进入Y中， 置换15N2气体使其转至烧瓶Z , 关紧活塞d, 由活栓f连通Z和V, 并翻开活塞c和g，从处加水至Z中。这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的储存瓶V中, 从V 排水至W瓶, 这种布置可阻止空气从活栓h 处回流 15N2气完全转移到瓶V中之后, 将它和瓶W一同, 从活栓f和g之间, 与整个安装系统开。;图.制备15N2的安装。X， 15N2发生器；Y，KMnO45%，w/v-KOH2.5%吸存器；Z，Na2SO420%-H2SO45%,v/v吸存器；V， 15N2 存储

6、瓶；W，排水存储瓶。1.蒸馏水，2.次溴酸盐-碘溶液；315NH42SO4；4. KMnO4 - KOH溶液;5. Na2SO4-H2SO4 。; 2.固氮测定安装和流程 固氮生长箱的室C与A和B经过涂抹硅油的磨砂平边接合在一同，在D、E、F、G和H管口有聚四氟乙烯栓塞阀，整个容器坚持气密形状。15N2依次经过碱性高锰酸钾溶液和酸性硫酸钠溶液并F口引入玻璃容器。在15N2 引入前，气密容器先用真空泵抽真空，当水下的泥土中由于负压冒出气泡时，继续且坚持几分钟后，然后引入15N2 使容器中的压力到达大气压。为了坚持作物的生理条件，运用空气泵经过二氧化碳缓冲溶液循环密封室上端的进口D和出口E的大气相

7、。缓冲溶液由混合物组成K2CO31/20M-KHCO31/10M，缓冲液的构成比例可以调理，以便顶部的CO2浓度维持在800ppm。;图.15N2暴露气密性生长室。A茎室；B，中间室；C，根室；D大气循环进口；E，大气循环出口；F， 15N2 气体入口；G，气体采样器附件；H，排水孔。; 3.同位素化学计量关系 设样品中N来自大气标志Natm和非大气非标志Nnon两部分组成，其15N原子百分超为Esample，且大气标志15N的原子百分超为Eatomsphere，那么由同位素质量平衡，有 那么，样品中的N来自大气标志N的比例为 atomsphereasamplenonaENENN）（atoms

8、heresamplenonaaatmEENNNP; 固氮的N量为 在整个固氮暴露过程中，也许由于系统外大气的泄入或土壤N2的发射对气相标志15N2的稀释作用，使得Eatomshere并不恒定，而是随时间减少的，因此计算时应取算术或积分平均值。atomsheresampletotalaEENN; 4.举例 参见：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-

9、559, 1980 表.在原位条件下水稻根际大气固氮与固定氮的植物吸收样品材料样品材料干重（干重（g） N N含量（含量（%）1515N N原子百原子百分超（分超（%）固固N量量（ g g）植物穗4.011.1600.00727茎和叶8.380.4100.01440根2.860.4120.04544土壤根区4000.1820.008481; 注：15N2被引入到固氮室上端的大气相，在水稻生长室继续固氮7天，期间上端大大气中二氧化碳的浓度一直维持在800ppm左右。实验最初和最终测定得到的气相标志N2的15N原子百分超分别为为14.1%和10%。 计算：对于茎和叶，有 参考文献 15N2 as a tracer of biological N2 fixation: A 75-year