D07 - 自相关函数和数据解析2014

1、 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved1 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved2自相关函数自相关函数理想情况下，相关函数在时间轴的前半部分完全衰减。得到的参数： 衰减时间衰减时间衰减时间与平移扩散系数成正比，因此也依赖于分子尺寸。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved3自相关函数自相关函数- 样品样品相关函数与溶液中的粒子有关： 平滑且连续 衰减指数从最大值2降至1 Wyatt Tech

2、nology Corporation 2014 All Rights Reserved4信号弱和纯溶剂信号弱和纯溶剂噪音很高或者没有明显衰减噪音很高或者没有明显衰减 纯溶剂的典型信号 函数值围绕1附近无规变化 逐渐达到1衰减的平滑度差衰减的平滑度差可能是由于样品浓度过低这种情况，可以尝试以下操作：延长采集时间增加采集次数提高激光功率（如果设置成手动） Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved5多模样品多模样品可观察到不止一个衰减可观察到不止一个衰减较快的一个代表较小粒子较慢的一个代表较大粒子长时间拖尾自相关函数无法到达基线自相关

3、函数无法到达基线相对于衰减时间，采集时间过短（这里显示的是大分子）尺寸分布分析误差更大尝试更长的采集时间*备注: 在更长的衰减时间内，增加采集数目无法捕获额外系数。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved6大粒子，大波动大粒子，大波动第二可见平台，第二可见平台，“脚脚”波动测定过程中，散射体积中颗粒浓度很低。样品需要离心或过滤这些采集必须标记出来总强度快速变化或者峰没有明确定义的总强度快速变化或者峰没有明确定义的基线基线可能由于出现汽泡，聚集体或者大颗粒；这些粒子可能超出了DynaPro的检测限（例如，一些微米尺寸粒子） 样品

4、需要离心或过滤这些采集点必须被标记（Mark） Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved7良好数据的获得良好数据的获得 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved81. 静电相互作用静电相互作用 带电荷分子，例如 蛋白质；通常配制较高浓度和低离子强度缓冲液。2. 粘度效应粘度效应样品本身导致的粘度；通常是高浓度的蛋白制剂。3. 多重光散射多重光散射光在到达检测器之前，被不止一个分子散射；通常指较大的纳米粒子（乳胶微球）和脂质体，其溶液通常是浑浊的。这些效应可能会相互

5、抵消这些效应可能会相互抵消!高浓度效应高浓度效应 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved9Dt 浓度为c时的平移扩散系数D0 外推至浓度为0时的扩散系数A2 第二维利系数，描述非特异性相互作用。M 摩尔质量f 第一阶摩擦系数 （通常与粘度有关） 较高浓度下的平移扩散系数较高浓度下的平移扩散系数较高浓度溶液的校正项稀溶液 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved10高浓度效应高浓度效应 示例示例:静电相互作用静电相互作用静电排斥力导致较高的Dt (表面上得到的Rh

6、较小)减弱这一效应：减弱这一效应： 稀释样品 增加缓冲液的离子强度 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved11样品本身使得溶液的总体粘度增加；Dt 下降，导致表观Rh 较高。高浓度效应高浓度效应 示例示例: DLS测定粘度测定粘度50 mM钙盐添加到缓冲液中DLS (圆形)粘度计(方形)In the example above, the Stokes-Einstein Relationship of a particle of known size was used to calculate solution viscosit

7、y. Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved12光在到达检测器之前，被不止一个粒子散射， 测得的Dt 要比真实Dt高得多，导致表观Rh偏小。高浓度效应高浓度效应 示例：多重光散射示例：多重光散射检测器入射光散射光示例：不同浓度下的乳胶球粒子重复测试三次研究Rh的浓度依赖性。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved13粒子尺寸分布分析（粒子尺寸分布分析（cumulants）拟合扩散常数的分布以获得扩散常数的平均和标准偏差，并计算rh的平均值和分布宽度。Inten

8、sityrh单模多分散单分散Intensityrh Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved14粒子尺寸分布分析（粒子尺寸分布分析（Regularization）以指数分布拟合数据，获得rh 的基本分布， 通常以直方图表示。IntensityrhIntensityrh多模多分散单分散 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved15尺寸尺寸 分布分布单模单模 vs. 多模尺寸分布多模尺寸分布单模单模% Pd 15%“均一的”: 尺寸分布仅限于蛋白的一种低聚物。结晶概率

9、最高。“多分散的”: 尺寸分布包含蛋白的一些无法分辨低聚物。蛋白峰 99.9% Mass多模多模尺寸分布实际上是单模态，无较大聚集体。“多模”: 为一些可分辨组分的尺寸分布包含大的非特异性聚集体且最不可能结晶。. Cumulants分析分析 (半径半径) 或者或者Regularization分析分析 (峰峰1 半半径，峰径，峰2半径半径)Regularization分析分析（峰（峰1半径，峰半径，峰 2半径半径） Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved16尺寸分布示例尺寸分布示例BLGA, 4 mg/ml, PBS, T =

10、25CPeaks: 1Mean Radius: 2.8 nm% Polydispersity: 13.8 %多数是单体多数是单体一个 “窄单模” 或者“单分散” 尺寸分布BLGA, 4 mg/ml, PBS, T = 5CPeaks:1Mean Radius: 3.4 nm% Polydispersity: 22.1 %二聚体数量逐渐增加二聚体数量逐渐增加一个宽单模或者 “多分散” 峰一个多模尺寸分布包含个别宽峰或者多分散峰BSA, 2 mg/ml, PBS, T = 25CPeaks: 2Peak 1: Mean Radius: 4.3 nm % Polydispersity: 32.1 %

11、单体，二聚体。三聚体单体，二聚体。三聚体Peak 2: Mean Radius: 130.9 nm % Polydispersity: 34.5 % 不同的非特异性聚集体不同的非特异性聚集体 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved17强度百分数，质量百分数和数量分布百分数强度百分数，质量百分数和数量分布百分数质量百分数和数量分布百分数向较小分数转移 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved18散射光强度（强度百分数）和质量或体积（质量百分散射光强度（强度百分数）

12、和质量或体积（质量百分数）计算出的尺寸分布数）计算出的尺寸分布质量质量-尺寸分布取决于分子形尺寸分布取决于分子形状：状：-对于无规线团高分子选择 “Coils”模式-对于蛋白和球形高分子选择 “Spheres”模式-“Rayleigh Spheres”模式对于半径大于10nm的分子，考虑进去了散射光强度的角度依赖性。-“Isotropic Spheres”适用于无角度依赖性样品 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved19Dynamics数据展示和计算数据展示和计算CumulantsRegularization相关函数先拟合，然

13、后计算平均值相关函数先拟合，然后计算平均值!相关函数先计算平均值，然后拟合相关函数先计算平均值，然后拟合! Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved20平均半径，多分散度和多分散指数的计算。平均半径，多分散度和多分散指数的计算。备注：备注： 这些计算适用于单模尺寸分布和多模尺寸分布的每一个单一模式。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved21平均半径的计算平均半径的计算 也可使用质量百分数进行类似计算 （% Mass）平均值是每一组数据的质量百分数（或强度百分数

14、）乘以半径计算得出的加权平均值 见上述公式.bins Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved22多分散度计算多分散度计算多分散度是质量分数（%Mass）加权平均得到的平均值分布的标准偏差。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved23多分散度百分数计算多分散度百分数计算多分散度百分数是多分散度除以平均Rh 然后再乘以 100 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved24多分散系数的计算多分散系数的

15、计算多分散系数是分散度的平方除以Rh的平方。 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved25Cumulants 或或Regularization得到的得到的Rh 估计估计(MW-R)摩尔质量摩尔质量 为你的样品选择合适的模型。 理想的尺寸分布是单分散的，否则估计到的Mw是测得的半径分布的加权平均值。 或者，寻找最佳匹配模型，根据已知分子量去估计样品的形状或者构象。Lysozyme: Rh = 1.9 nmMw = 14 kDa Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserve

16、d26 Dynamics 分析方法（DynaLS vs. Legacy） 测定坐标轴比率附录附录 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved27Dynamics 分析方法分析方法(v. 6.10 或者更高版本或者更高版本) Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved28分析方法比较分析方法比较AnalysisDynalsDynamics 6.10LegacyPrior to Dynamics 6.10 Particle Size DistributionRegular

17、ization 使用 DynaLS 分析包使用专利运算法，与DynaLS类似多模分散或单分散CumulantsCalculate Polydispersity set to TRUE对ACF进行第一和第二Cumulant拟合并缩短负的衰减速率对ACF进行单一指数拟合，且衰减速率分布呈指数变化单模多分散CumulantsCalculate Polydispersity set to FALSEACF的单一指数拟合ACF的单一指数拟合单模单分散 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved29 Perrin方程衍生出的：“F”（椭球面的

18、摩擦系数与f0的比值，f0是硬球的摩擦系数）与长椭圆面和扁椭球的axial ratio之间的关系方程。 第一，计算f0， f0 是Stokes摩擦系数，与半径为Rsph 的硬球以速度v 在溶剂中运动的摩擦力有关，溶液粘度是： 如果我们忽略溶剂化作用 (水合作用), 蛋白的硬球半径Rsph 可通过硬球体积和它的半径的关系方程，根据已知摩尔质量（Mw）， 微分比容（ ），和阿伏伽德罗常数（NA ）计算出来：Axial Ratio的测定的测定 Wyatt Technology Corporation 2014 All Rights Reserved30 第二，测定f，假设粒子是椭球体，其中f是粒子的摩擦系数，