两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究

1、两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研 究 于彩虹 1 张显涛 1 宋英男 1 张帅 1 路兴波 2 孙红炜 2 * ( 1.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院，北京100083； 2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100 ) 摘要： 利用富集及驯化培养方法，从长期生产农药的企业废水处理系统及厂房周边的污染土壤和池水 中，分离筛选出两株能够高效降解乙酰甲胺磷的菌株Y3 、Y6 。在形态特征和生理生化鉴定的基础上，对 其 16S rDNA 序列进行了分析， 并重点研究了它们对乙酰甲胺磷及其它农药的降解特性和抗性。 结果表明， Y3、Y6分别为寡养单胞菌(Stenot

2、rophomonas)和假单胞菌(Pseudomonas)。Y3、Y6在乙酰甲胺磷浓度 分别为500 mgL-1和1000 mg -L-1，培养温度30 C,初始pH 8.0 ,接种量为2.5%条件下，一周内可以将80% 左右的乙酰甲胺磷矿化为磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏对降解效率的研究表明，当酵母膏含量为1g L-1时， 降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，会相对抑制农药的降解。抗性实验显示，Y3、 Y6 均可在较高浓度 的其它有机磷类及氨基甲酸酯类农药的普通培养基中生长，对其它农药的抗性也比较广泛。植物侵染实验 显示， Y3、 Y6 对试验中的豆科、禾本科、十字花科及葫芦科植物不具备致病性，说

3、明Y3、 Y6 环境安全 性较强。 关键词： 乙酰甲胺磷；菌株；降解特性 Isolation, identification and degradation characteristics of two acephate-degrading bacteria 1 1 2 2 * Yu Caihong Zhang Xiantao Song Yingnan Lu Xingbo Sun Hongwei (1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology(Beiji

4、ng), Beijing 100083; 2.Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100) Abstract: In this study, by the method of enrichment and domestication, we isolated two strains of bacteria desig nated as Y-3 and Y-6, respectively, from the wastewater treatme nt system o

5、f the pesticide en terprise as well as the soil and water around its workplace. The traditional morphology, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequenee analysis were applied to the bacteria classification. The characteristics of degrading acephate and the resista nee of any other p

6、esticides were also studied. The results showed that stra ins Y-3 and Y-6 were identified as Stenotrophomonas sp and Pseudomonas sp. With the initial acephate concentration 500 and 1000 mg -L , the initial pH value 8.0, 30 C, the ratio of bacteria suspension (OD6oo=2)2.5%, the completely degradati o

7、n rates were both about 80%. The study also dem on strated that the optimum content of the yeast extract was 1g L , while the content of the glucose inhibits the degradation of acephate. The resistance experiments showed that, Y-3 and Y-6 could also be found in higher concen trati ons of other types

8、 of orga nic phosphorus and carbamate pesticides in the general growth medium, which have more extensive pesticide resistance. Plant infection experiments showed that, Y-3 and Y-6 almost do not have any pathogenicity on the Leguminosae, Gram in eae, Cruciferae and Cucurbitaceae pla nts, safe to the

9、environment. Key Words: acephate; stra in; degradati on characteristics 乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为 O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，是杀虫剂甲胺磷 的N-乙酰基衍生物，分子量183.16，结构式为: OO CH3 S 、 P NH C CH3 CH3 _ O / 乙酰甲胺磷是一种高效、低毒、低残留、持效 期长、内吸性强的广谱性有机磷杀虫剂。从2007 年1月1日起，中国已全面禁止在农业生产中使用 甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等 5 种高毒农药，乙酰甲胺磷作为替代高毒农药的一种 主打产

10、品而广泛应用于我国蔬菜、果树和水稻等作 物的害虫防治1 。2007年乙酰甲胺磷在中国的产量 仅有4000吨，近年来起产量逐年剧增，有望成为万 吨农药品种2。 虽然，人们一直认为乙酰甲胺磷是一种低毒农 药，对环境安全性高，被广泛用于粮食、蔬菜和水 果生产中，但近年来在中国很多地区的蔬菜、茶叶 及海鲜产品的农药残留检测中都发现乙酰甲胺磷的 残留超标问题3,4,5,6,7，研究表明乙酰甲胺磷在菠菜 中代谢较慢，30%的乙酰甲胺磷采用1100ml/hm2的 施药量在15天后，仍能够检测到乙酰甲胺磷的残留 8。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易对 水体造成污染，在莱州湾海域部分地区能检测到的 乙酰甲

11、胺磷含量较高9。而且乙酰甲胺磷在植物和 动物体内很容易被代谢成毒性更高的甲胺磷。最新 的水生物毒理学研究表明，亚致死浓度的乙酰甲胺 磷对萼花臂尾轮虫实验种群动态具有显著的影响。 随着乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用，相关农 药废水的处理、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留等 问题会越来越突出，并且农药给环境带来的副作用 在使用后很长时间才能显现出来。因此，如何降低 乙酰甲胺磷的污染和残留问题变得日益重要。 土壤中的有机污染物主要是依靠微生物降解， 所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生 化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应 急性，来快速降解各类人工合成的农药，使其完全 矿化成无机物，是

12、目前最有潜力最有效的研究方法 之一 10,11 。而迄今为止，人们对于乙酰甲胺磷的微 生物降解菌的研究较少。因此，分离筛选具有高效 降解乙酰甲胺磷农药的微生物，对消除农药污染、 净化环境及社会的可持续发展具有重要的现实意 义。所以本研究的目的是从农药污水处理池中采样， 通过富集和驯化培养，获得以乙酰甲胺磷为唯一碳 源的高效代谢菌株，对其进行菌种鉴定，并测定降 解特性及致病性。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 培 养基 （均加 1L 蒸馏水，农药适量添加） 液体富集培养基：牛肉膏 3g, 蛋白胨 10g, NaCl 5g 液体驯化培 养基： NaNO3 1.0g, NaCl 0.5

13、g, K 2HPO4 1.5g, KH 2PO4 0.5g, （NH4）2SO4 0.5g, MgSO 40.5g, 酵 母膏 0.5g （可加入 15g 琼脂制成驯化平板划线分 离） 降解测定培养基： KNO 3 1.0g，（NH 4）2SO4 0.5g，KCl 0.5g，酵母粉 0.05g 1.1.2 药品与试剂 92%的乙酰甲胺磷原药（取自山东华阳农药集 团），其它试剂均为分析纯 （购自北京中北林格生物 科技有限公司） 。 1.1.3 样品采集 采自山东华阳农药集团厂房周边，以及厂区污 水处理系统曝气池曝气泵周围的土样、水样，该厂 长期生产有机磷杀虫剂及其它各类农药。 1.2 菌种的富集

14、与驯化 对取到的样品先进行富集培养，起初选择药液 的浓度为 50mg/L ，以周为单位更换培养基并逐步提 高农药选择液的浓度（具体时间以富集效果而定， 有时适当延长富集培养的时间） 。当富集培养液中的 选择液浓度至少达到 500mg/L 后， 转入驯化培养基 培养。配备相应的固体培养基平板，驯化过程涂布 观察以及划线分离。将得到的菌株在一般环境下， 粗测降解效率较高的两株菌命名为Y3、Y6，作为 重点研究对象，并用甘油液封，-20C保藏。常用待 测的菌种置于乙酰甲胺磷为 5000mg/L 的斜面培养 基5 C保藏。 1.3 两株降解细菌的鉴定 1.3.1 生理生化特性测定 按照微生物学实验 1

15、2，对筛选到的 2株细 菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶、淀粉水解、尿素 反应、硝酸盐还原与糖醇利用等生理生化特性以及 温度、 pH 值适应范围及耐盐性的测定。 1.3.2 16S rDNA 扩增、序列测定及同源性比较 菌株基因组的鉴定采用 16S rDNA 序列分析的 方法。使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 Y3,Y6 的基因组 DNA ，以此为模版 PCR 大量扩增各菌的 16S rDNA 序列。 PCR扩增正向弓I物为 F: 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ；反向引物为 R： 5-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3 。 PCR反应程序：

16、94 C预变性 5min , 94 C变性 30s, 54 C 退火 50s, 72C 延伸 1.5min , 30 个循环， 72 C延伸8min。然后用1%琼脂糖电泳检测 PCR产 物。 得到的16S rDNA序列扩增产物用 DNA回收纯 化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限 公司测序。 测得的序列登陆 NCBI 网站,通过 Blast 程序与 Genbank 中核酸数据进行比对分析构建系统发育 树。 1.4 乙酰甲胺磷降解量的检测 使用钼蓝比色法 13 ,直接测定反应后培养液中 磷酸根离子的质量,从而间接确定细菌直接矿化乙 酰的量。菌种在降解测定培养基内培养一段时间, 取 1mL

17、 反应后培养液定量稀释加入 50mL 的容量瓶 内,然后加入 5ml 钼酸铵溶液和 3ml 抗坏血酸溶液, 用水稀释至刻度 ,摇匀。于室温下放置 10min 后测定 其 OD720 的值,对照标准工作曲线,求出50mL 容 量瓶内PO43-的浓度WP,进而求出1mL待测液中彻 底降解的乙酰甲胺磷的量,公式如下： 降解的乙酰的量 m=(Wp X M y)/ 20 X Mp 其中Mp PO43-的分子量，值为95; My乙酰 甲胺磷的分子量,值为183。 降解率 w=(1000X m/m0) X 100% m0初始加入的乙酰甲胺磷浓度。 1.5 菌母液的制备 将各菌接入液体普通培养基过夜培养,待培

18、养 基完全浑浊后以蒸馏水为空白测定吸光度,加适量 生理盐水将菌液调至 OD600=2.0备用。 1.6 环境条件对菌株降解乙酰甲胺磷的影响 1.6.1 农药浓度对降解率的影响 粗测得 Y3 、 Y6 降解效率相对较强,单独进行 测定。 农药浓度设 100, 200, 500, 1000, 2000mg/L 5 个梯度,初始 pH 为 7.0, 2.5%的接种量接菌,于 30C, 150r/min 的摇床内振荡培养。一周后测定乙 酰甲胺磷降解量和降解效率。 (用 1.4节的方法) 1.6.2 初始 pH 对降解率的影响 选择 Y3、Y6 最适宜的农药浓度,初始 pH 设 5.0, 6.0, 7.

19、0, 8.0, 9.0 5个梯度, 其它条件同 1.6.1。 一周后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。 1.6.3 接种量对降解率的影响 选择Y3、Y6最适宜的农药浓度和初始pH ,接 种量设 0%，1%，2.5%，5%(体积比，所配菌悬母 液 OD600=2.0) 4个梯度，其它条件同 1.6.1。一周 后测定乙酰甲胺磷降解量和降解效率。 1.6.4 酵母膏含量对降解率的影响 选择 Y3、 Y6 最适宜的农药浓度、初始 pH 和 接种量，酵母膏含量设0, 1, 2.5, 5g/L 4个梯度， 其它条件同1.6.1。一周后测定乙酰甲胺磷降解量和 降解效率。 1.6.5外加葡萄糖量对降解率的影响

20、选择Y3、Y6最适宜的农药浓度、 初始pH、接 种量和酵母膏含量，外加葡萄糖量设0,2.5, 5,10g/L 4个梯度，其它条件同 161。一周后测定乙酰甲胺 磷降解量和降解效率。 1.6.6温度对降解率的影响 选择Y3、Y6最适宜的农药浓度、 初始pH、接 种量、酵母膏含量和外加葡萄糖量， 设20, 25, 30, 35, 40 C 4个梯度，其它条件同161。一周后测定 乙酰甲胺磷降解量和降解效率。 1.7降解菌对其它农药抗性的测定 选择该农药厂长期生产的有机磷类的敌敌畏、 辛硫磷、毒死蜱、马拉硫磷、氧化乐果；氨基甲酸 酯类的灭多威、克百威、异丙威、速灭威、涕灭威 作为外加农药，分别加入富

21、集培养基和驯化培养基。 初始浓度为 100mg/L ,并逐步提高农药浓度至 1000mg/L，接种量为 1%，于 30 C, 150r/min 的摇 床内振荡培养，48h后通过测定OD600的比浊度变 化，确定生长状况，进而表明降解菌对其它农药的 抗性能力。 1.8降解菌的环境安全性测定 根据Y3、Y6菌属鉴定的结果，参照植病研 究方法14，选择此类菌属较易致病的几个科属（豆 科、禾本科、十字花科及葫芦科）的典型植物作为 初步确定其环境安全性。 2结果 2.1降解菌株的分离与鉴定 2.1.1高效降解菌株的确立 富集驯化培养的同时，通过稀释平板、划线分 离的方法，分离得到的9株细菌均能在乙酰甲胺

22、磷 浓度5000mg/L以上的农药平板上生长。然后，逐一 检测各个菌株的降解能力。乙酰甲胺磷初始浓度设 置为 100, 200, 500, 1000mg/L,用 2.4 节的方法 检测。经降解试验发现9株菌具有降解乙酰甲胺磷 的能力（表1）,分别标记为：Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9。9菌株对乙酰甲胺磷的降解率对 比发现，各菌株间差异性较大。从中选出在高农药 浓度环境下降解率较高的Y3和Y6作为研究对象。 对象，使用叶片穿刺的方法，进行植物侵染实验, 2.1.2降解菌株的形态特征及生理生化特性 表1.细菌Y1Y9不同农药浓度下5天对乙酰的降解效率 Tabl

23、e 1 The degradation rate of bacteria 丫1丫9 in 5 days on different acephate concentrations 100mg/L 200mg/L 500mg/L 1000mg/L Y1 20.9% 36.8% 38.0% 25.4% Y2 35.3% 54.3% 62.7% 42.0% Y3 90.7% 72.1% 84.6% 54.2% Y4 60.6% 59.1% 28.7% 11.4% Y5 34.6% 12.2% 14.9% 12.2% Y6 48.3% 31.0% 53.6% 65.9% Y7 20.9% 25.5% 6

24、2.7% 45.3% Y8 18.1% 14.8% 33.9% 31.0% Y9 9.2% 22.4% 29.7% 25.1% 在光学显微镜下观察发现， Y3和Y6分别呈短 杆状和球状。普通培养基平板上培养48h后，Y3 菌落近圆形、黄褐色、无光泽、中央稍隆起、边缘 整齐；Y6菌落近圆形、淡黄色、无光泽、中央凸起、 边缘不整齐，有的呈小齿状.2个菌株的革兰氏染 色分别呈阴性，有鞭毛。好气性试验表明 2个菌株 均为好氧性菌。它们的生理生化特征以及温度、 pH 值适应范围和耐盐性见表 2和表3。 表2.降解菌株的生理生化特性 Table 2 Physio-biochemical character

25、istics of the degrading bacteria 生理生化特性 Physio-biochemical characteristics Y3 Y6 淀粉水解 Starch hydrolysis 过氧化氢实验Catalase test + + 吲哚实验Indol test + + 伏普实验（V.P） V.P test + 甲基红实验（M.R ） M.R test 石蕊牛奶实验Litmus milk test + 尿素实验Urease test + + 明胶水解 Gelatine hydrolysis 硫化氢实验 Hydrogen sulfide test 柠檬酸盐实验Citrate

26、 test + 葡萄糖发酵 Glucose fermentation + + 蔗糖发酵 Sucrose fermentation + D-果糖发酵 D-Fructose fermentation D-木糖发酵 D-Xylose fermentation D-甘露糖发酵 D-Mannose fermentation L-阿拉伯糖发酵 L-Arabinose fermentation 注：“+”表示菌株反应阳性，-”表示菌株反应阴性。 10 20 30 40 5013 5 9 11 13 Y3 + + + + + + Y6 + + + + + + + 菌株 氯化钠浓度（ gL-1 ) Strain

27、s Salt concentration/(g L-1) 10 2050 80 100 Y3 + + Y6 + + + 注：“+”表示菌株能够生长，-”表示不能菌株够生长。 Note: The signs “ +” “ ” meanthe strains growing and not growing respectively. 2.1.3降解菌株16S rDNA的PCR扩增及分析 将所得2菌株的16S rDNA序列结果通过 Blast 程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统 发育树如图2和图3。结果表明，菌株 Y-3（genbank 登 录号：lcl|28163）与 Y-6（ge

28、nbank 登录号： lcl|20815）的16S rDNA序列和嗜性菌的结构相似， 其中Y6还具有假单胞菌的序列结构。结合分离菌 株的生理生化等特性（表2和表3）和16S rDNA 序列比对分析结果，初步鉴定菌株Y3为寡养单胞 菌属，Y6为假单胞菌属。 Note: The signs “ +” “ ” mearihe strains positive reaction and negative reaction, respectively. 表3.降解菌株的温度、pH值与耐盐性测定 Table 3 The measurement of temperature range, pH value

29、area and salt-tolerance of the degrading bacteria 菌株 温度C） pH Strains Temperature/(C) pH value 图3 Y3、Y6降解率随农药浓度的变化 ；3 2.2.1农药浓度对降解率的影响 100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 图4 Y3、Y6降解率随pH的变化 n a d a 率 解 降 g3rp?iotfophotuonas sp. EO( AF15 6*05) Sreaon-ophoiHonas .YC-1(DQ537219) Sf blank is on the

30、right.) 均不具有致病性，环境安全性比较理想。 本研究筛选到的 Y3菌株按照16SrDNA分子鉴定结果 3 讨论 获取高效有机磷农药降解菌的主要途径是从受 污染的土壤、污泥等受污染的环境介质中筛选、驯 化、富集和分离。目前，研究较多的主要是细菌和 真菌。细菌在生化上具有多种适应能力，容易诱发 产生突变菌株，在有机磷农药降解中占有主要地位 15 。细菌包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆 菌属(Baccillus)、节细菌属(Arthrabacter )、棒状杆菌 属 (Corynobacterium )、黄杆菌属 (Flavobacterium )、 黄 单 胞 杆 菌 属

31、 (Xanthamonus) 、 固 瘤 细 菌 属 (Azo-tomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等；真菌有： 曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium )、木霉属 (Trichoderma)、酵母菌等；藻类对有机磷也有降解 作用，如小球绿藻属 (Chorolla )降解甲拌磷、 对硫磷 等16,17。 假单胞菌属是最为常见的有机磷降解细菌的代 表，国内外许多学者都从土壤中分离到了假单胞菌 属的不同菌株，这些细菌能够降解甲基对硫磷、对 硫磷、蝇毒磷、久效磷、甲胺磷、二嗦农、异硫磷， 马拉硫磷、敌敌畏、乐果、甲拌磷等几乎所有种类 的有机磷农药 18。

32、寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas) 属于黄单胞 菌科 (Xanthomonadaceae) ，黄单胞菌科原是假单胞 菌科(Pseudo mon adacea的一个属，1981年被归为 一个独立的菌科 19。寡养单胞菌属目前确定的种名 有 S. acidaminiphila 、S. dokdonensis、S. koreensis、 20,21,22 S. maltophilia 、 S. nitritireducens 、S. rhizophila。 应为该菌属中的 S. acidaminiphila 。寡养单胞菌属作 为农药降解菌的研究相对较少，国内有关于寡养单 胞菌属对除草

33、剂降解的研究 23 ，国外则多是其对 PAHs(多环芳香烃)和 4NA( 4-硝基苯胺)的降解 研究 24,25，该类菌属对于有机磷农药降解的研究尚 属首例。其中该菌属的嗜麦芽寡养单胞菌(S. maltophilia )的研究相对较多，嗜麦芽寡养单胞菌 在自然界广泛分布， 在水、土壤、植物根系及食物 (冷 冻鱼类、牛奶、禽蛋等 ) 等都有该菌的存在；医院 环境如透析装置、氧气湿化罐、血压计、人工呼吸 装置、通气管道等也都能分离到该菌；同时该菌也 是人和动物皮肤、胃肠道和呼吸道较为常见的定植 菌。其本身是一类多种动植物的致病菌 26，本文中 进一步对所筛选的 2 株菌株进行了植物侵染实验， 所得

34、到的 2 株菌株对豆科、禾本科、十字花科中的 部分典型植物均不表现致病性，说明对植物的致病 性风险较低，但是对于其动物致病性实验还有待进 一步的研究。 环境中的污染物通常是多种复杂的，应用微生 物去除土壤、水中的污染物，要求菌株对其他污染 物具有较高的抗性。本文中所得到的菌株对包括有 机磷农药多种农药都存在较强的抗性，尤其对于氧 化乐果和辛硫磷的抗性很高，很有可能这 2 种细菌 对乙酰甲胺磷、氧化乐果和辛硫磷存在相似的代谢 途径。 微生物对农药等有机污染物降解有多种途径 , 有的微生物能完全矿化农药为小分子的无机物 , 有 的微生物将农药分子降解为次级产物 , 而次级产物 的积累有可能产生新的

35、环境污染。本研究中通过检 测的微生物将乙酰甲胺磷转化成磷酸根的含量来确 定微生物的代谢活性，因此，这两种细菌对乙酰甲 胺磷具有很高的矿化作用，对于处理农药废水、进 一步开发去除农药残留的菌剂和酶制剂有很好的应 用前景。 4 结论 (Conclusions) (1) 通过富集驯化培养的方法， 筛选到 2 株高效降 解乙酰甲胺磷的细菌，经鉴定分别属于寡养单胞菌 属和假单胞菌属，该菌可以将乙酰甲胺磷矿化成磷 酸根，具有很好的应用效果。 (2)Y3 降解乙酰甲胺磷的最适条件为：培养温度 为30 C, pH=8.0，农药初始浓度500mgL-1,接种量 2.5% ; Y6降解乙酰甲胺磷的最适条件为：培养

36、温度 为35 C，pH=8.0，农药初始浓度1000mg- L-1，接种 量2.5%。添加一定浓度的酵母膏有利于菌株对乙酰 甲胺磷的降解，当浓度为1g/L时效果最好。葡萄糖 的加入则对各菌降解农药的过程均产生抑制作用。 (3)2菌株对其它有机磷及氨基甲酸酯等杀虫类农 药均具有一定的抗性作用，且环境安全性较强。 tocontaminateGorundwaetrJ. Ecoto.Environ.Saf. 2000(45):7986. 4 高海红 . 邯郸市 2008 年蔬菜中 28 种农药残留 的检测 J. 职业与健康 , 2009(9):5153. 5 6 7 钱峰 . 茶叶合格率不足七成小型私

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