大量培养诱导乳腺癌患者自体DC和CIK细胞的研究一

1、大量培养诱导乳腺癌患者自体 DC 和 CIK 细胞的研究 （一）作者：王先明何劲松陈伟财王敏闵军邵静 【摘要】目的探讨获得大量乳腺癌患者自体树突状细胞 （ dendriticcells,DCs ） 和 细 胞 因 子 诱 导 的 杀 伤 细 胞 （cytokine-inducedcells,CIK细胞）的可行性。方法实验组，乳腺癌患者 经外周血干细胞动员，取 50mL 外周血分外周血单个核细胞（ PBMC）， 用AIM-V无血清培养基培养 DCs和CIK，并设健康人对照组，用 RPMI1640 完全营养培养基。结果实验组 PBMC 产出 2108个并诱导出 1.2 107 个 DCs和 2 1

2、09个 CIK 细胞，显著高于对照组（ P0.01）。 DCs的 CD86、 CD11c和 HLA-DR分子都有较高表达， CIK细胞 CD3+、 CD56+双阳性细 胞达到 14.41%。细胞毒实验提示 CIK 细胞有强大的杀瘤活性。结论乳 腺癌患者经外周血干细胞动员，用 AIM-V 无血清系统培养，少量外周 血可诱导大量优质自体 DCs和 CIK细胞。【关键词】乳腺癌；干细胞动员；树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤 细胞 Abstract ObjectiveToinvestigatethepossibilityofthegenerationoflargenumbersofauto logous

3、DendriticcellsandCytokine-inducedkillercellsfrombreastcancerpatien tsbyperipheralbloodstemcellsmobilized.MethodsPeripheralbloodstemcells ofbreastcancerpatientsweremobilizedbyusingrhGM-CSF.Peripheralbloodm ononuclearcells(PBMC)from50mLperipheralbloodofbreastcancerpatients(experiment)andhealthydonors(

4、control)wereisolatedbyFicollgradientcentrifu gationrespectively.DcsfromadherentPBMCweregeneratedbyusingrhGM-CS F、 IL-4andTNF- inmediumAIM-V(experiment)orRPMI1640(control).CIKcellsfr omnon-adherentPBMCweregeneratedbyusingINF- ,I-L1 ,I-L2andanti-CD3 MoAbinmediumAIM-V(experiment)orRPMI1640(control).Res

5、ultsThenumb erofPBMC,DCsandCIKcellsis2 108,1.2 107and2 109inexperimentalgroup, whichissignificanthigherthanthatincontrolgroup(P0.01).ThepercentageofC D3+CD56+cellsinCIKcellsis14.41%.DCshighlyexpressedCD86 、 CD11candHLA-DRinbothgroups.CytotoxicactivityofCIKcellagainstBel-7402is 20.36%,26.62%,34.09%an

6、d36.12%intherateofeffectandtargetcells5:1,10:1, 20:1and40:1.ConclusionThestudysuggestedthatlargenumbersoffullmature autologousDendriticcellsandCytokine-inducedkillercellscangeneratefrombr eastcancerpatientsbyperipheralbloodstemcellsmobilizedandsuitforadoptiv eimmunotherapyofbreastcancerpatients.KeyW

7、ordsBreastcancer;DendriticCells;Cytokine-inducedcells 树突状细胞( DCs)是目前发现功能最强的专职抗原呈递细胞( APC)， 是唯一能激发静息的 T 细胞产生免疫应答的 APC，在肿瘤免疫中具有极 其重要作用 1，2。CIK细胞是非 MHC 限制细胞毒性淋巴细胞， CIK细 胞的主要效应细胞是高度增生的 CD3+、 CD56+双阳性表型 T 细胞，又 被称为 NK细胞样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK 细胞的非限制性杀瘤优点，在体外可大量扩增 3，DCs和 CIK细胞 理想的过继性免疫治疗细胞。但临床应用仍受到很

8、大限制，一是由于 常规培养基含有异种血清，二是常规由患者 PBMC 诱导达到治疗量自 体 DCs和 CIK细胞，需大量外周血。 我们对乳腺癌患者进行外周血干细 胞动员和用 AIM-V 无血清培养基培养，探讨获得大量自体 CDs、CIK细 胞和建立符合临床治疗标准的培养诱导系统的方法。1 材料和方法1.1 材料RPMI1640 干粉、胎牛血清、 L-谷氨酰胺（ L-glutamine）和青霉素 -链霉 素双抗（ Gibco 公司）；2-巯基乙醇（ 2-mercaptoethanol）均购自 Sigma 公司； Ficoll 淋巴细胞分离液（相对密度1.077 0.001g/m）L 购自Lymph

9、oprepTM公司；重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF）、 白细胞介素 4（IL-4）、肿瘤坏死因子 -（ TNF-）均购自 PEPROTEC公H 司；藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人 CD11c与 HLA-DR、异硫氰酸 （FITC） 标记小鼠抗人 CD86和 CD80荧光单克隆抗体购自 Pharmingen 公司；小 鼠抗人 CD54（Clone： 6.5B5）和 HLA-DR（Clone：CR/43）单克隆抗体 均购自 DAKO公司；双标记免疫细胞化学染色试剂盒购自 MaixinBio 公 司；人 IL-12（p40、p70）ELISA检测试剂盒均购自 Diaclone 公

10、司。 1.2 方法1.2.1 动员乳腺癌患者外周血干细胞和分离外周血单个核细胞乳腺癌患 者皮下注射 GM-CSF6gkg-1 d-1，共 5d，第6天抽取外周血 50mL，为实验组。同时取等量健康人外周血做为对照组。用 Ficoll 密度梯度离心法 分离 PBMC，分离步骤按产品说明。1.2.2诱导 DCs采用 GM-CSF、IL-4和TNF-诱导 DCs4。 用 AIM-V无血 清培养基将实验组 PBMC 密度调到 510，6 在 75cm2 培养瓶， 37、 5%CO2、培养 2h。洗去并收集非贴壁细胞备用诱导 CIK 细胞。贴壁细 胞用含 800U/mL人重组 GM-CSF和500U/m

11、L人重组 IL-4的AIM-V无血 清培养基培养，每 3 天更换新培养基及细胞因子，第 5 天加入 50U/mL 人 TNF-，第 7 天收获成熟 DC。对照组采用 RPMI1640培养基培养 （含 10%灭活胎牛血清， 2mmol/LL-glutamine、50mol/L2-mercaptoethano ， P-S双抗 100U/mL），细胞因子及培养方法同实验组。1.2.3诱导 CIK细胞参照 WolfCIK细胞诱导法 3，并做必要修改。用 AIM-V 无血清培养基将实验组非贴壁 PBMC密度调至 110，6第 0 天培养基内 加入 1000U/mL，培养 24h 后加入抗 CD3 单克隆

12、抗体 50ng/mL ， IL-1100U/mL和 IL-2300U/mL。每 3d 更换新培养基和细胞因子并调整细 胞密度至 2105。对照组用 RPMI1640培养基培养（含 10%灭活胎牛血 清，2mmol/LL-glutamine、50mol/L2-mercaptoethano ，P-S双抗 100U/mL， 25mmol/L HEPE）S，细胞因子及培养方法同实验组。1.2.4流式细胞检测 DC表型CD86、CD11c和HLA-DR，检测 CIK表型 CD3 和 CD56。1.2.5 细胞毒分析采用乳酸脱氢酶释放法检测 CIK 细胞的细胞毒活力。 方法简述如下：在 U 形底 96 孔板行细胞毒检测每孔置靶细胞Bel-740210000个/100L，自然释放孔内靶细胞 10000/200L，最大释放孔 内置靶细胞 10000/200L 含 1%TritonX-100，背景孔内置 200L 培养基， 实验孔每孔含靶细胞 10000个/200L 和不同数量 CIK细胞，效靶比例