蛋白类药物生产

1、蛋白类药物生产工艺蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域， 目前的生化产品主要是从动物脏器 或组织包括人的血液中分离而得。 20 世纪 70 年代后，人们开始应用基因工程技术生产一 些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、 TNF 等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。第一节 主要蛋白质类药物的制备 蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏 蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被 动免疫、替代疗法等。一、蛋白质激素类 蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、

2、促性腺激素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋 白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素 (TSH)、促卵泡激素 (FSH)等。促 性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素 (HCG) 、血清促性腺激素 ( SGH )等。其他蛋白质激素包 括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。(一) 生长素 (growthhormone，GH) 生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素， 具 有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。人生长素( human growth hormone，hGH)由一条 191 个氨基酸的多肽构成的一链多肽 的球形蛋白质， 分子中含两条二硫

3、键， 分子量为 21700，等电点 4.9，沉降系数 S20，W 2.179， 其活性不需要整个分子结构， N 端 1134氨基酸为活性所必需， C 端的肽链起到保护作用， 其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素 包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫 性质等都有较大差别。 生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。1生长素的传统生产方法传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图 11-1 所示。提取分级沉淀前处理传统的工艺过程如下 材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻， -20 冷冻保存。

4、 预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。 匀浆 取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调 pH 至 5.5，置组织捣碎 机中匀浆。 提取 对匀浆以水抽提， 10 000rpm离心 30min；取沉淀，以 pH 4.0的0.1molL 硫 酸铵溶液抽提，离心（同上） ，取沉淀，再用 pH 5.5的 0.25molL 的硫酸铵溶液抽提，离 心，取上清抽提液。 沉淀 调节抽提液 pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为 lmol L，离心，取上 清液。 再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至 1.8molL ，离心，得沉淀。 除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，

5、得透析内液。 等电点沉淀 将所得透析内液用 HCL 或NaOH分别依次于 pH 4.0和 pH 4.9进行等 电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。 盐析 调上清液 pH为 4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为 1.25molL盐析，离心，得 沉淀物。 除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含 0.1molL 氯化钠的 Tris-HCL (pH 8.5) 缓 冲溶液进行透析，得透析内液。凝胶过滤 透析内液上 Sephades G-75凝胶柱，用含 0.1 mol L 氯化钠的 50mmol L Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性 GH 存在于第峰中。透析 将活性峰部分

6、对 6.5mmolL的硼砂-盐酸(pH 8.7)缓冲溶液进行透析， 得透析 内液。层析 将透析内液上 DEAE-C(DE-52)柱，用含 00.3molL 氯化钠的 6.5mmolL 硼砂-盐酸 ( pH 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得 GH。2人生长素的基因工程法hGH 的种属特异性很强， 动物生长激素不能用于人， 所以开始时 hGH的惟一来源是从 人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。目前已利用基因工程技术 生产出 hGH，美国的 Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的 hGH 产量高达 1.5g/L，这也 是第一代重组人生长激素，商品名

7、称为 Protropin.生产路线如图 11-2 所示。图 11-2 利用基因工程菌生产生长素的工艺路线()1)工艺过程如下： 工程菌的构建 利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列， 使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。 菌种繁殖 采用 M9 培养基，添加 CAA（ 酪蛋白氨基酸 ） ，调节 pH 至 70，置于摇 床上， 30，进行菌种培养繁殖。 发酵 培养基同菌种繁殖培养基， 种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为 1618h， 温度为 37，pH7.07.5，溶解氧不能低于 20%。 补料发酵 在发酵进行 57 h后，需要适量

8、补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、 CAA、 无机盐和微量无素，如 PO43-、Fe2- 、 Co2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期 延，发酵菌体产量增加了一倍。 其余的发酵条件与上述条件相同， 菌体生长至稳定期放罐。 。 离心 将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由 10 mmol/L Tris 和 1mmol/L EDTA 组成的缓冲溶液（ pH 7.5），80rpm 搅拌 1h，离心，收集上清液。 粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度 45%，4放置 2h，10000rpm离心 30min， 收集沉淀。 脱盐 沉淀用 10 mmol/L Tris 和 1mmol/LE

9、DTA 组成的 pH 值为 8.0 的缓冲溶液溶解， 用 Sephadex -G25脱盐。 纯化 采用 Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose 进行色谱，再加入固体硫酸铵达到 饱和浓度 45%，沉淀 2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacryl S-11HR 及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品 .。（2）质量检验：质量必须符合 2005 年版二部附录规定。 目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大 规模的生产，从而造福人类。（二） 胰岛素 （ insulin ）胰岛素是胰脏中胰岛 细胞分泌的一

10、种蛋白质激素，它是促进合成代谢的激素，在调节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主 要激素之一。广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200 万个胰岛，占胰脏总质量的 1.5。胰岛由 、 和 三种细胞组成，其中 细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝 素，细胞制造胰岛素， 细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在 细胞中开始时是以活性 很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血 糖作用。临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂 症、休克等。胰岛素由 A、B两条链组成， A 链含 21个氨基酸残基，

11、B 链含 30个氨基酸残基，两链 之间由两个二硫键相连，在 A 链内部含有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大 致相同，主要差别在 A链二硫桥中间的第 8位、9位和 10位上的三个氨基酸及 B链C末 端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。生产胰岛素的方法较多，有传 统的方法和基因工程技术方法。1动物胰脏制胰岛素由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。其工艺路线如图 11-3 所示。提取碱化盐析去脂硫酸 pH3.63.8 减压浓缩除酸性蛋白水，丙酮，氨水 pH4.24.3 锌沉淀除碱性蛋白，结晶 柠檬酸，醋酸锌

12、，丙酮，氨水 pH8.0,5以下过滤后调 pH6.0图 11-3 酸醇法生产胰岛素的工艺路线1）工艺过程如下： 提取 冻胰块用刨胰机刨碎，加入 2.32.6倍的 86 88乙醇（质量分数）和 5草酸，在 122搅拌提取 3h，离心。滤渣再用 1倍量 68 70乙醇和 0.4草酸提取 2h， 离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。 碱化、酸化 边搅拌提取液边加入浓氨水调 pH 8.0 8.4 （12 2），立即过滤，除 去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至 pH 3.63.8，降温至 5，静置 4h 以上， 使酸性蛋白充分沉淀。 减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀

13、物弃去，取上清 液，30以下减压蒸去乙醇， 浓缩至浓缩液相对密度为 1.041.06 （约为原体积的 1 101 9 为止 ）。 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内， 5min 内加热至 50后，立即用冰盐水降温至 5，静置 34h，分离下层清液 （脂层用于回收胰岛素 ）。用盐酸调 pH 2.3 2.5，于 222 搅拌加入 27 （质量体积分数 ）固体氯化钠，保温静置数小时。析出物即为胰岛素粗品。 精制 盐析物按干重计算，加入 7 倍量蒸馏水溶解，再加入 3 倍量的冷丙酮，用 4molL 氨水调 pH 4.24.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为 73。充分搅拌 后，低温 5以下放置过夜

14、，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4molL氨水使 pH 6.26.4，加入 3.6（体积分数）的醋酸锌溶液 （浓度为 20），再用 4molL氨水 调节 pH 6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。 结晶 将沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷2柠檬酸 50mL 、6.5醋酸锌溶液 2mL 、丙酮 16mL，并用冰水稀释至 100mL，使其充分溶解， 5以下，用 4molL 氨水调 pH 8.0，迅速过滤。滤液立即用 10柠檬酸溶液调 pH 6.0，补加丙酮，使 整个溶液体系保持丙酮含量为 16。慢速搅拌 35h 使结晶析出。在显微镜下观察，外形 为正方形或扁斜形

15、六面体结晶，再转入 5左右低温室放置 34d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙 醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素（ 2）质量检验 测定胰岛素效价， 各国药典规定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。（3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面： 胰脏质量是胰岛素生产中的关键， 在我国是一个薄弱环节。 工业生产用的原料主要 是猪、牛的胰脏。不同种类和年龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高 于猪胰。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在 -

16、30以下急冻后转入 -20保存备用，如用液氮速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛 素含量较高，如单独使用可提高收率 10。 浓缩 浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。如采用离心薄膜蒸发器，在第一 次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免 了胰岛素效价的损失。 产品纯度 在常规的结晶胰岛素中， 除了胰岛素主成分外， 还含有其他一些杂蛋白 抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰 岛素原的含量显著降低。2人胰岛素的制备（1）酶促半合成法 猪与人的胰岛素差别仅是 B30 位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。利

17、用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素 B30苏氨酸 （丁酰基 ）丁酸，通过硅 胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人 胰岛素。（2）利用基因工程技术制备目前，国际上生产医用重组人胰岛素 （ recombinant human insulin, rhI）的方法主要有 3 种1）用基因工程大肠杆菌 （ Escherichia coli, E.coli ）分别发酵生产人胰岛素 （ human insulin, hI）的 A 、B 链。然后经化学再氧化法 ,使两条链在一定条件下重新形成二硫键 ,得到 hI。这一 方法缺点较多 ,目前已较少使用。2）用

18、基因工程 E. coli 发酵生产人胰岛素原 （ human proinsulin, hP I） ,后经加工形成 h I。 这种方法， E. coli 系统表达量高 ,但缺点是不利于表达 hI 这样的小蛋白 ,产物易降解 ,故常采 用融和蛋白形式将 hPI 连接在一个较大的蛋白质后 ,表达产物需经过一系列复杂的后加工才 能形成有活性的 hI。3）通过基因工程酵母菌发酵生产 hP I,经后加工形成 hI 。酵母系统下游后加工比细菌表 达系统简单 ,但缺点是生产慢 ,生产周期长 ,且重组蛋白分泌量少 （150 mg/L） ,产量低。工艺生产过程见图 11-4。 菌种RRhP I/pQE-40 E.

19、coli M15 菌株 培养基培养基组成为： 5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L 硫酸铵, 2.5 g/L葡萄 糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨苄青霉素, 50mg/L 卡那霉素, pH 7.2。 一次发酵将 10 ml 经过活化的 RRhP I/ pQE-40 E.coliM15 转移至 100 ml 培养基中进行培养 , 活化 菌种。 发酵罐培养将一次发酵液转移至含有 1.5 L 培养基的发酵罐中进行发酵罐培养 （转速为 300 r/min, 通气量为 11. 511.8） ,一段时间后加入一定量新鲜的培养基并用 NaOH 调节 pH。在对 数

20、生长中期加入 0.5mmol /L IPTG 并升温诱导 RRhPI表达 4 h,转速随即调为 400500 r /min, 增大通气量至 1 1.81 2.0,继续培养一段时间后 ,收集菌体。 包涵体的收集和洗涤将收集的湿菌体冻存于 -20,然后悬浮于缓冲液 A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/LEDTA,50 mmol/L NaCl, 5% 甘油, 0.10.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 5 6 ml/g湿菌)中,加入溶菌 酶( 5 mg/g湿菌体) ,室温或 37振荡 2 h。冰浴超声 10 s 30次,其间每次间隔 20 s,功率为 200W。1

21、0条件下 1000 g离心 5 min 去除细胞碎片。上清液中的包涵体 ( Inclusion body, IB) 在4 条件下 27000 g离心15 min收集,然后用含 2 mol/L 尿素的缓冲液 A充分悬浮,室温静 置 30 min 后 4 条件下 17000 g离心 15 min,收集沉淀。沉淀再用含 2%脱氧胆酸钠的缓冲 液A充分悬浮, 4 条件下 17000 g离心 15min,收集沉淀。最后沉淀用 10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3洗涤两次 (4,17000 g离心 15 min ) 。 RRhPI 的初步纯化将收集的 IB用含有 0.1%0.3% -巯基乙醇

22、的缓冲液 B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿 素, pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液 B平衡的 DEAE-Sepharose FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱 , 收集含 RRhPI 的洗脱液。 RRhPI 的重组复性将初步纯化后的 RRhPI通过 Sephadex G-25脱尿素,转换缓冲液为不同 pH 的50 mmol/L Gly-NaOH 重组液,或含有适量 GSSG的 Gly-NaOH 缓冲液中 ,使蛋白终浓度为 0.10.6 mg/ml, 收集趋于正确折叠的 RRhPI单体组分,加入适量 GSH 和GSSG,4放置 24 h。 酶切转化向 RRhPI 复

23、性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶 , 37酶切一段时间 , 然后用 0.1 mol/L ZnCl 2 终止反应并沉淀生成的 hI。 hI 的纯化将 0.6g IB 分别用含 0.1%, 0.2%, 0.3% -巯基乙醇的 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿素 , pH8.0 溶解,进行 DEAE-Sepharose FF 离子交换层析 ,然后将收集得到的 RRhPI 组分通过 Sephadex G-25脱尿素以使 RRhPI 复性。图 11-4 利用基因工程菌生产人胰岛素的工艺路线 (仿自李晓红， 2007 )蛋白质类细胞生长调节因子蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素

24、( IF)、，、白细胞介素 1-18 (IL) ，神经生 长因子( NGF)、肝细胞生长因子 (HGF) ，血小板衍生的生长因子 (PDGF)，肿瘤坏死因子 (TNF) ，集落刺激因子 (CSF)，组织纤溶酶原激活因子 (t-PA)，促红细胞生成素 (EPO)，骨发 生蛋白(BMP)等。(一) 干扰素 ( Interferon ,IFN )干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白 质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其 获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的 “免疫力 ”，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的 作用，是人体防御

25、系统的重要组成。人干扰素根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素 (IFN-、)类淋巴细胞干扰素 (IFN- 与 IFN-的混合物 )、成纤维细胞干扰素 (IFN- 、)T 细胞 干扰素 (IFN- 等)几类。按其抗原性的不同，分为 型、 型和 型三种，同一型别，根据 氨基酸序列的差异， 又分为许多亚型，如常用的 IFN-包括 IFN- a、IFN- Ib和 IFN-b 等亚型。干扰素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破坏， 不被 DNase 和 RNase 水解破坏等特性。干扰素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。1传统的体外诱生法 传统的方法是通过体外诱生的方法获

26、得干扰素。干扰素具有高度的种属特异性，临床 使用的干扰素都用人的细胞制备， -干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备； -干扰素用人成纤维细胞制备。 目前我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法， 达到 106Umg 蛋白的水平。其工艺路线见图 11-5图 11-5 诱生法生产干扰素的工艺路线(1)工艺过程如下： 分离灰黄层 取新鲜血液 400mL/ 份，加入 ACD 抗凝剂，离心，分离出血浆，小心 抽取灰黄层。每份血可抽取 1315mL，放置 4冰箱中过夜。 氯化铵处理 每份灰黄层加入 30mL 缓冲盐水， 再加入 9 倍体积量的 0.83 冷氯化 铵，混匀， 4放置 10min，4离心

27、(8000 r/min) 20min。弃上清液，加入适量缓冲盐水，收 集沉淀细胞，制备悬浮液，重复上次处理，溶解残存的红细胞。取沉淀的白细胞悬于培养 液中，冰浴保存，取样作活细胞计数。 启动诱生 于白细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其浓度为100 gmL，37水浴搅拌培养 2h。 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒 (在 10 天龄鸡胚中培养 48 72h，收获尿 囊液)使其最后浓度为 100150血凝单位 mL，在37搅拌培养过夜。 仙台病毒诱导人白 细胞产生。 收集 将培养物离心 (2500 r/min) 30min ，吸取上清液即得粗制干扰素。 纯化 在粗制干扰素中加入硫氰化钾到 0.5

28、molL，用盐酸调 pH为 3.5，离心，得 沉淀l。沉淀1加入原体积 15量的冷乙醇( 94)，离心，得上清液 1。上清液 1用盐酸调节 pH 5.5 ，离心弃去沉淀，再调至 pH 5.8 ，离心，得上清液 2 和沉淀 2。沉淀 2 加入原体积 150量的甘氨酸-盐酸缓冲液 (pH 2)溶解，得 IFNl 。上清液 2用NaOH调节 pH值至 8.0， 离心，弃上清液，得沉淀 3。沉淀3加原体积 150量的0.lmolL PBS和0. 5molL硫氰 化钾(pH 8)溶解，pH值降至5.2，离心，得上清液 3和沉淀 4。 沉淀4加原体积 125000 量pH 为8.0的0.1molL PBS

29、溶解，调至 pH为77.5，对 PBS ( pH 7.3)透析，过夜，离 心，收集上清液，检测，得 IFN- 。调节上清液 3 pH值为3.0，离心，得沉淀 5。沉淀 5加 入原体积 15000量的 pH 8.0，0.1molL PBS，加NaOH调节pH 77.5，对 PBS ( pH7.3) 透析过夜，离心，收集上清液，检测，得 IFN- 。(2)质量检验 我国用微量板染色的病变抑制法测定。国际上规定，能保护50%细胞免受病毒攻击的浓度即为一个 IFN 活性单位。该法特点是一次纯化量大， 回收率高于 60；经济，简便，易于普及，效价可达 1.2 108U mL，比活 2.2 106 Umg

30、(蛋白)。IFN-中干扰素含量占回收干扰素的 82，比活也比较 高。2基因工程法 随着生物技术的发展，运用基因工程技术，已能在人体外大规模地生产人干扰素即基 因工程干扰素。 目前，编码干扰素的基因已能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。 、 三型基因工程干扰素都已研制成功，并投放市场，用于治疗的病种达 20 多种。我国卫生部 已批准生产的干扰素品种有 IFN- l、b IFN- a、IFN- b和IFN-r 四种。目前，人们在利 用蛋白质工程技术研制活性更高，更适于临床应用的干扰素类似物和干扰素杂合体等各种 新型干扰素。生产技术路线如图 11-6 所示图 11-6 利用基因工程生产干扰

31、素的工艺路线 基因工程菌的构建首先从产生干扰素的白细胞中提取干扰素 mRNA ，对其进行分级分离。通过蟾蜍卵母 细胞找出活性最高的 mRNA ，并用此 mRNA 合成 cDNA 。将 cDNA 与含四环素和氨苄抗性 基因的质粒 pBR322 重组，转化大肠杆菌 K12，得到重组子质粒。对每个重组子用粗提的 干扰素 mRNA 进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒 DNA 放到无细胞合成系统 中进行翻译。对翻译体系的产物进行干扰素活性检测。再将干扰素的 cDNA 转入大肠杆菌 表达载体中，转化大肠杆菌在特定条件下进行高效表达。其生产流程如图 11-7 所示。图 11-7 构建干扰素工程菌的一

32、般流程 工程菌的发酵a. 种子制备 将构建的基因工程菌传代后于 -70下甘油管中保存。如构建的人干扰素 -b 基因工程菌 SW-IFN-abE.coli-DHSa。质粒用 PL 启动子，含氨苄西林抗性基因。 使用时进行活化。b. 种子罐培养 将菌种按 1种量接种到种子培养基， 种子培养基的配方： 1蛋白胨、0.5酵母提取物、 0.5NaCl；30摇床培养 10h，作为发酵罐种子使用。c. 发酵罐培养 发酵培养基的配方： 1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.01NH4Cl、0.05 NaCl、0.6Na2HP04、0.001CaCl2、0.3KH2P04、0.01MgS04、0.4葡萄糖、 50mg

33、 mL 氨苄西林、少量防泡剂。用 15 L 发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为 10 L， pH 6.8， 搅拌 500 r/min，通风比为 1：1 (m3min) ，溶氧为 50。30发酵 8h，然后在 42诱导 2 3h完成发酵。同时每隔不同时间取 2mL 发酵液，在 10 000 r/min 离心除去上清液，称量菌 体湿重。在整个发酵过程中，要注意： ( 1)不同发酵阶段培养基的成分有差异； ( 2)培养液中 要有足够的溶解氧，不同的培养阶段需要的溶解氧量也不同，通常通过增大搅拌速度，增 加空气流量或者通入纯氧来满足条件； (3)发酵过程中在不同的阶段应控制不同的 pH，发 酵后期要降

34、低 pH，减少干扰素的水解；(4)要控制适当的温度，既要保证菌体细胞膜的完 整和细胞中酶的活性，又要有利于提高干扰素的产量。 产物的提取与纯化a.提取 发酵结束后，冷却，离心 (4000 r/min)，30min，收集沉淀，得湿菌体。取湿菌 体悬浮于 20mmol L 的磷酸缓冲液 (pH 7.0)中，冰浴中进行超声破碎，释放干扰素蛋白。 4000 r/min 离心 30min，得沉淀，用含 8mol L 尿素、20mmol 磷酸缓冲液 (pH 7.0)、0.5mmol L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌抽提 2h，然后 15000 r/min离心 30min。取上清液，用 20mmol L 磷酸缓

35、冲液 (pH 7.0) 稀释至尿素浓度为 0.5mol L ，加二巯基苏糖醇至 0.1mmolL，4 搅拌 15h，15000 r/min 离心 30min，除去不溶物。上清液经截流量为 104相对分子质量的中 空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素b 溶液经过 SephadexG-50 分离，层析柱(2cml00cm)先用 20mmolL 磷酸缓冲液 (pH 7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收 集人干扰素 b 部分，经 SDS-PAGE检查。b纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰素 b组分，再经 DE-52 柱(2cm50cm) 纯化，人干扰素 b 组分上柱后用含 0.05

36、mol L 、0.1mol L、0.15mol L NaCl 的 20mmolL 磷酸缓冲液 (pH 70)分别洗涤，收集含人干扰素 b 的洗脱液。全过程蛋白质回收率 为 20 25，产品不含杂蛋白、 DNA 及热原质。干扰素 b 含量符合要求。3干扰素质量检验 基因工程干扰素半成品和成品均应作检测，包括干扰素效价、蛋白质含量及比活性、 纯度测定 、相对分子质量、残余外源性 DNA 含量、残余血清 IgG 含量、残余抗生素活性 、 干扰素效价测定、无菌试验、热原质试验。成品检测：物理性状 冻干制品外观应为白色或微黄色疏松体，加入注射水后，不 得含有肉眼可见的不溶物； 鉴别试验 应用 EIASA

37、 或中和试验鉴定 ,结果为阳性； 水分 测定 用卡氏法，水分含量应低于 3。半成品也要进行无菌试验、热原质试验、干扰素 效价；安全试验 取体重 350400g豚鼠 3 只，每只腹侧皮下注射剂量为人每千克体重 临床使用最大量的 3 倍，观察 7 天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，则说明成 品合格。(二) 人红细胞生成素 ( rhEPO)1结构与性质红细胞生成素 (EPO)是一种糖蛋白， 是调节红系祖细胞， 对红细胞生成有特异刺激作用 的细胞因子，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，在成人体内主要由肾脏分泌，在病理状态下， 与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关。红细胞生成素有两种，天然人红细

38、胞生 成素和重组人红细胞生成素。天然人红细胞生成素是以人的尿、血等为原料，经生物化学 方法纯化得到。 重组人红细胞生成素是以重组 DNA 技术生产的红细胞生成素， 将人红细胞 生成素的基因连接到表达载体上， 转化 CHO 细胞，从细胞培养上清夜中纯化红细胞生成素。 两种人红细胞生成素具有相同的体内体外活性，根据其糖基的不同，可以分为rhEPO-和rhEPO-两种。2生产工艺图 11-8 利用基因工程菌生产人红细胞生成素的工艺路线工艺路线如图 11-8 所示。 克隆并筛选人红细胞生成素基因 获得人红细胞生成素基因的方式有两种， 一种 提取人胚胎 mRNA ，逆转录合成 cDNA 文库，筛选文库，

39、得到人红细胞生成素基因，也可 以通过筛选人胚胎基因组文库获得。另一种是提取胚胎染色体 DNA ，通过 PCR 扩增获得 基因片段，再体外拼接。 构建红细胞生成素基因表达载体 与编码红细胞生成素基因片段相连的表达载体 有 pDSVL 、pSV2 和 pD11。以构建携带编码人红细胞生成素基因的核苷酸序列（ prEP）的 质粒为例进行说明。从人胚胎中提取总 RNA ，逆转录合成 cDNA, 进行文库筛选，得到人 红细胞生成素基因， 将该基因与载体在连接体系中过夜 , 加入 T4 DNA 连接酶。挑取单菌落 接种于 5mL 培养基， 37过夜。 建立红细胞生成素表达的细胞株 将重组质粒导入哺乳动物细

40、胞，经筛选得到所 需要的细胞系，冻存备用。 重组细胞株的培养 将冻存的细胞株取出， 37水浴解冻，离心，弃去冻存液。 采用转瓶培养细胞，将解冻的细胞株接种于适量的 DMEM 培养基， 37、CO2培养箱中培 养，连续传代三次。采用消化酶将细胞消化，使细胞浓度为 2.5 106 个/mL，接种。采用生 物反应器培养重组细胞株，采用 DMEM 培养基，加含小牛血清，控制条件 pH 7.0、搅拌速 度小于 50 r/min, 37、DO为 50 80，使细胞贴壁；细胞贴壁后提高转速 80100 r/min， 培养 10d；更换无血清培养基在进行灌流培养， 在此过程中， 连续收获培养液， 在 4 8

41、保存。 红细胞生成素的分离纯化 采用三步法纯化红细胞生成素，将培养液通过滤膜过 滤，上 CM-Sephrose亲和色谱柱， CM 柱预先用 Na-HAc-异丙醇活化， 20mmol/L Tris-HCL 平衡缓冲液平衡，然后用 02mol/L Tris 洗脱液洗脱，收集洗脱峰， 10mmol/L Tris 透析液 中透析过夜。透析过程中，透析液的体积为蛋白液体积的 15倍，换液 4 次， 0.22um滤膜 过滤。活性组分上平衡过的 DEAE 离子交换柱， 01mol/L NaCL-HCL 洗脱液洗脱，收集 活性洗脱峰，再上 10乙腈平衡的 RP-HPLC 柱， 10 70的乙腈洗脱液洗脱，收集

42、活 性洗脱峰，再用 20mmol/L 柠檬酸盐缓冲液平衡凝胶柱，并进行洗脱，收集活性洗脱峰， 即为红细胞生成素。 红细胞生成素的活性检测 红细胞生成素的活性可以通过放射免疫分析和体内生 物活性分析，体内生物活性的测定可以采用网织红细胞计数法。在生产过程中， 重组细胞株的培养必须要注意是无菌条件、 温度 37、气体交换可靠、 pH 稳定 7.07.2、葡萄糖是必不可少的碳源，另外采用生物反应器时要能及时添加培养液 保证连续培养、载体要有足够的表面积，使得细胞株得以高密度、高表达连续培养。 (三)白细胞介素 -2(Interleukin-2 ，IL-2)白细胞介素 (interleukin ，IL

43、) 由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和 介导作用的一类细胞因子，是淋巴因子家族的一员。目前已有IL-1 18。许多白细胞介素不仅介导白细胞的相互作用，还参与其他细胞如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、 神经细胞、成骨细胞和破骨细胞等的相互作用。 IL-2 主要由 T 细胞或 T 细胞系产生， 脾脏、 淋巴结和扁桃腺中的 T 细胞受到刺激后都能产生 IL-2 ，人和动物某些 T 细胞白血病细胞系 或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体 （如 A23187） 或 PMA 刺激下可产生高水平的 IL-2 白细胞介素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。1. 白细胞介素 -2 的传

44、统生产方法IL-2 是由辅助 T 细胞经抗原或 有丝分裂 原等刺激，在巨噬细胞或单核细胞分泌的 IL-1参与下，产生并分泌的含 133 个氨基酸的糖蛋白，分子量为 15420。在 pH 为 29 范围内 稳定， 56 1h内仍具有活性。临床上主要用于治疗一些免疫功能不全及癌症的综合治疗白细胞介素 -2 的传统生产方法是通过诱生的方法获得。工艺路线如图 11-9 所示诱生除杂蛋白浓缩洗脱 凝胶层析图 11-9 诱生法生产白细胞介素 -2 的工艺路线 诱生 用加入鸡瘟病毒和 PHA 的培养液培养人外周血白细胞，这两种物质起到联合刺激的作用， 37培养。 除变性蛋白 用 6molL HCl 调节 p

45、H2.02.5，再用 6molL NaOH 调回到 pH7.2 7.4，离心除去变性杂蛋白。 硫酸铵分级沉淀 取上述离心后的培养上清液，加饱和硫酸铵至 35饱和度， 4 静置 24h，离心弃去沉淀。上清液补加固体硫酸铵至 85饱和度， 4静置 24h，离心，收 集沉淀。 透析 将沉淀溶于 pH 6.5、10mmolL PBS中（内含 2正丁醇和 0.15mol/L NaCL） 对pH 6.5、10mmolL PBS透析24h(更换 5次透析外液)。 蓝色琼脂糖层析 将上述透析内液通过 Sepharose4B层析柱，用 PBS 洗去不吸附的 蛋白，再用含 0.4molL NaCl的PBS洗涤亲和

46、柱，最后用含 1.0molL NaCL 的PBS解吸 IL-2 活性组分。 凝胶层析 将解吸的 IL-2 活性组分经分子量为 6000 的 PEG 浓缩，再上 ACA44U1-trogel 层析柱。柱用含 0.1PEG、 2正丁醇和 pH7.6 的 0.5molL 甘氨酸的 0.2mol/L Tris-HCL 洗脱，得 IL-2 。2基因工程 IL-2 的制备目前国内用酵母、动物细胞培养和用大肠杆菌基因重组的 IL-2 都已批准生产，并用于 临床。 重组 IL-2 的获得过程中，已成功地利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞来表达重组 人 IL-2 ，但在大量生产重组 IL-2 中主要是使用大肠杆菌

47、。 基因工程菌的构建从 ConA 激活的人白血病 T 细胞株提取高活性 IL-2 的 mRNA 作为模板，逆转录单链 cDNA ，经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在 cDNA 末端连接若干 dCMP 残基，再以寡聚 (dG)1218 为引物，利用 DNA 聚合酶 I 成双链 cDNA ，经蔗糖密度梯度离心法分离出此 cDNA 片段。通过 GC加尾法将此 cDNA 片段插入到 pBR322质粒的 PstI 位点，用重组质 粒转化大肠杆菌 K12 株 X1776，得到 IL-2 的 cDNA 文库。利用 mRNA 杂交试验筛选 IL-2 cDNA 文库得到含 IL-2 cDNA 质粒的菌株。 已有一些

48、携带人突变型白细胞介素 2 ( IL-2) 的 质粒，如 pPIC9K 等。 基因工程菌的发酵将IL-2 工程菌接种于含氨苄青霉素的 2 mL YPD 培养基中 , 过夜培养 , 以1 %接种入含 100 mL BMGY的500 mL 三角瓶。 30 300 r/ min 培养至OD600 = 36 (大约1618 h)。弃上清液并将菌体细胞沉淀悬浮在 1/ 5 到1/ 10 原初始培养液体积的 BMMY 培养基中 ,0.5 % 到5 %甲醇诱导。在此过程中优化表达条件 , 如通气状况、诱导时间（表达量随时间延长逐 渐增加,培养48 h 达到高峰值）、初始pH 值、甲醇终浓度（目的蛋白量在甲醇

49、浓度为 1%时 达到最高）等。外源蛋白在甲醇酵母中的表达分 2步, 即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以 甘油为碳源的培养基上培养菌体 , 达到一定OD 值后, 离心, 弃去上清液 , 菌体悬浮于以甲 醇为碳源的培养基中诱导表达 , 每隔24 h 加1次甲醇 , 以弥补甲醇的损失。 IL-2 的分离IL-2 基因工程菌经发酵培养和诱导表达后，发酵液离心，收集菌体。菌体悬浮于 PBS 溶液中，超声破碎，离心沉淀，用 PBS洗 3次，尽量去除杂蛋白及核酸，离心粗制包涵体， 包涵体主要含由 IL-2 单体分子聚合而成的多聚体， 不溶于水， 且其中的重组 IL-2 无生物活 性。 蛋白溶解 包涵体经常出现

50、不溶解现象，使用高性能分散机，瞬间打开分子间的化学键，有利于 变性剂继续打开蛋白质分子间和分子内的化学键，使蛋白完全溶解。可用6mol L 盐酸胍或 8mol L 脲或尿素使包涵体变性解聚成单分子 （变性后仍无生物学活性 ）。 IL-2 的复性采用50 mol/L CuSO的4含有PBS的溶液与 IL-2粗品以1：50体积混合后 , 置室温过夜。 。 也可利用空气氧化，或还原型谷胱甘肽复性，恢复 IL-2 二硫键和正常分子结构，获得生物 学活性。 提高 IL-2 的复性率在复性过程中 ,只有 60%70%的 IL-2 能正确配对 ,另有 30%40%的 IL-2 则会形成错 配体和二聚体 ,收

51、集生产过程中经高效液相色谱洗脱下来的错配体和二聚体（色谱峰的左部 分）进行重新氧化复性 ,可以使 IL-2 的回收率提高 20%以上。 IL-2 的纯化用 7mol L 尿素溶解 IL-2 包涵体，得到上清液，上清液经过 SephadexG-100凝胶过滤和分子量为 650的蛋白质纯化系统 DEAE 离子交换层析，得均一的 IL-2 ，纯度高达 98， 比活性达 4.3 106Umg 蛋白，回收率为 30.8。进一步纯化重组 IL-2 是利用 IL-2 的疏水 性，经超滤浓缩后利用反相高效液相层析 (RP-HPLC)和较高浓度的乙腈 (60 )的流动相进行 梯度洗脱，从而得到高纯度的 IL-2

52、 ；也可以通过受体亲和层析一步纯化， 可得到纯度为 95 以上的 IL-2 。3质量检验IL-2 生物活性用 3H-TdR 掺入法测定。三、血浆蛋白类血浆蛋白质类包括白蛋白 (Alb) 、纤维蛋白溶酶原、血浆纤维结合蛋白 (FN)、免疫丙种 球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白， Veil， s病免疫球蛋白，抗 -D 免疫球蛋白，抗 -HBs 免疫球 蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原 (Fg)，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子等。不 同物种间的血浆蛋白质存在着种属差异，虽然动物血与人血的蛋白质结构非常相似，但不 能用于人体。(一)白蛋白(1) 结构和性质白蛋白又称清蛋白，是人血浆中含量最高的蛋白质，约占总

53、蛋白的55，对人没有抗原性。白蛋白为单链，由 584 个氨基酸残基组成， N-末端是天冬氨酸， C-末端为亮氨酸， 相对分子质量为 65000，pI值为 4.7，沉降系数 S20,w 4.6，电泳迁移率 5.92。可溶于水和半 饱和的硫酸铵溶液中，一般在饱和度为 60以上的硫酸铵析出沉淀。对酸较稳定，受热后 聚合变性，但仍较其它血浆蛋白质耐热。在白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸的盐，能提 高蛋白的热稳定性，利用这种性质，可使白蛋白与其它蛋白质分离。从人血浆中分离的白蛋白有两种制品：一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清白蛋白；另一种是从健康产妇胎盘血中分离制得的，称胎盘血白蛋白。同种白蛋白制品

54、无抗原性，主要功能是维持血浆胶体渗透压。在临床上用于失血性休克、严重烧伤、低蛋白血症等的治疗。2）生产工艺工艺路线如图 11-10 所示人血浆络合分离图 11-10 白蛋白生产的工艺路线工艺流程： 络合 将人血浆放入不锈钢夹层反应罐内， 开启搅拌器，碳酸氢钠溶液调节 pH 8.6， 加入等体积的 2利凡诺溶液，充分搅拌，静置 24h，分离上清液与络合沉淀。 解离 沉淀加无菌蒸馏水稀释， 0.5mol L HCL 调节 pH 值至弱酸性，加入 0.15 0.2氯化钠，不断搅拌进行解离。充分解离后， 65恒温 1h，立即用自来水夹层循环冷却将解离液进行离心，分离液用不锈钢压滤器澄清过滤。 超滤 澄

55、清滤液用超滤器浓缩。 热处理 浓缩液在 60恒温处理 10h，灭活病毒。 除菌 以不锈钢压滤器过滤，通过 Sartoltis 冷灭菌系统除菌。 分装 白蛋白含量及全项检查合格后， 用自动定量灌注器进行分瓶灌装或冷冻干燥 得白蛋白成品。本品分为 10与 25两种蛋白浓度规格。3）质量检验 性状呈淡黄色略带黏稠状的澄明液体或白色疏松物体（冻干品 ），pH 6.67.2；冻干制剂水分含量不超过 1；其纯度为白蛋白含量应占蛋白含量的 95以上；残余硫酸铵含量应不超过 0.01（gmL） 。其它无菌试验、安全试验、毒性试验、热原试验均应符合卫生部白蛋白制造及检定人血浆供应有限，血液来源中各种传染病病源较

56、多 ,来自人源血浆的白蛋白在纯化过程 中难免将病毒带入最终产品，利用基因重组技术生产白蛋白则可避免病毒感染。重组人血 清白蛋白成为一种趋势。（二）人血丙种免疫球蛋白（1）结构与性质人血丙种球蛋白即 免疫球蛋白 （ Ig ），是一类主要存在于血浆中、 具有抗体活性的糖蛋 白，其抗体成分存在于 和 r 球蛋白部分。具有被动免疫作用。免疫球蛋白约占血浆蛋白 总量的 20，除存在于血浆中外，也少量地存在于其他组织液、外分泌液和淋巴细胞的表 面。免疫球蛋白具有被动免疫、被动 -自动免疫以及非特异性。在临床上可用于预防流行性 疾病如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘和丙种球蛋白缺乏症。（2）生产流程生产流程线如图 11-11 所示图 11-11 人血丙种球蛋白生产的工艺路线（3）生产工艺 络合 人血浆放入不锈钢夹层反应罐内，开启搅拌器，碳酸钠溶液调节pH 8.6，加入等体积 2 利凡诺溶液，充分搅拌，静置 24h，分离上清液与络合沉淀。 盐析 取上清部分，在不锈钢反应罐中开启搅拌器，并以 lmolL盐酸调 pH 7.0， 加 23结晶硫酸铵，充分搅拌后沉淀静置 4h 以上。 离心 吸去清液，将下部混浊液泵入离心机中离心，得沉淀。 溶解 将沉淀用适量无热原蒸馏水稀释溶解。 层析 通过 DEAE-Seph