代谢组学开展实验方案

1、代谢组学实验方案代谢组学实验方案实验方案和实验细节终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代谢组学解释代谢组学解释代谢组学实验基本思路如何终止如何终止关键因素：酶活、温度、溶剂、时间关键因素：酶活、温度、溶剂、时间方法：方法：60%甲醇、甲醇、50%甘油水溶液；甘油水溶液；5min，1h.如何分离如何分离关键：菌体形态；发酵液关键：菌体形态；发酵液粘稠度粘稠度方法：离心，过滤方法：离心，过滤如何提取如何提取如何监测如何监测如何分析如何分析如何解释如何解释核心问题关键因素关键关键：细胞壁：细胞壁方法：

2、超声破碎、研磨、反复冷冻方法：超声破碎、研磨、反复冷冻关键关键：是否具有挥发性；论文目的：是否具有挥发性；论文目的方法：方法：GC-MS；LC-MS；或者两者联用；或者两者联用关键关键：数据是否具有同步性？系统误：数据是否具有同步性？系统误差小差小方法：方法：Matlab、NIST library、Golm metabolome database、AMDIS关键关键：解释：解释FK506高产原因高产原因方法：与方法：与FK506的合成相关联（前体？的合成相关联（前体？分支代谢？能量？）分支代谢？能量？）终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取

3、胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代谢组学解释代谢组学解释终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）方案方案一一【1】5mL20mL甘油：水=3:2【1】Villas-Bas, S.G. and P. Bruheim, Cold glycerolsaline: The promising quenching solution for accurate intracellular metabolite analysis of microbial cells. Analytical Biochemistry, 2007. 370(1): p. 87-97.【2】Smart, K.F., et al

4、., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10): p. 1709-1729.【3】Blling, C. and O. Fiehn, Metabolite Profiling of Chlamydomonas reinhardtii under Nutrient Depriva

5、tion. Plant Physiology, 2005. 139(4): p. 1995-2005.方案二方案二【2】5mL20mL甘油：生理盐水水=3:25min5min关键：终止酶活方法：胞内温度-10溶液温度：根据细胞壁的厚度而定策略：用甲醇或者甘油降低水的凝固点公式：Tf = Tf* Tf = Kf*m（m为溶液的质量摩尔浓度，Kf 为凝固点下降常数）方案二方案二【3】5mL20mL甲醇：水=3:2（可变动）5min培养基与菌体分离培养基与菌体分离终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代

6、谢组学解释代谢组学解释关键： 菌体的形态、发酵液的粘稠度方法：离心【1】淬灭液双蒸水0.22m0.45m0.8m1.0m失败原因：失败原因：丝状菌体，相互交联，堵塞孔径。淀粉、葡萄糖、和糊精灭菌后，本身就是一种“浆糊”，严重堵塞孔径废液缸1.转速和时间 时间一般为4min5min，转速的大小根据具体的菌体而定：离心结束后，菌体刚好贴在管壁，不结团，加入PBS或蒸馏水后，轻微震荡即可重新悬浮。2.天然复合培养基面临天然复合培养基面临的难题的难题 天然复合培养基（主要为蛋白胨、酵母粉）成分复杂，如果清洗不干净，会混入提取液中，严重影响实验结果3.生理盐水中的生理盐水中的NaCl和和PBS中的钠盐、

7、钾盐会干扰实验结果中的钠盐、钾盐会干扰实验结果。整个过程必须带手套，枪头不能接触其他物质。整个过程必须带手套，枪头不能接触其他物质。4.FK506发酵液的处理发酵液的处理转速为2700rpm，4min采用去离子水洗涤菌体将培养基中的酵母粉（不溶物）改为酵母提取物（可溶）过滤清洗【2】淬灭液PBS或生理盐水或蒸馏水菌体沉淀重复三次【1】Smart, K.F., et al., Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization follow

8、ed by gas chromatography-mass spectrometry. Nat. Protocols, 2010. 5(10): p. 1709-1729.【2】Ding, M.-Z., X. Zhou, and Y.-J. Yuan, Metabolome profiling reveals adaptive evolution of <i>Saccharomyces <i>cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics, 2010. 6(1): p. 42-55.终止反应（淬

9、灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代谢组学解释代谢组学解释胞内代谢物提取胞内代谢物提取关键因素：细胞壁G+菌菌单层单层，（，（2080nm），），组组分分简单。简单。90%的肽聚糖的肽聚糖（含量高，交联度大），（含量高，交联度大），10%的胞壁酸。的胞壁酸。G-菌菌多层，（多层，（10-15nm），），组组分复杂。内壁层还有较分复杂。内壁层还有较少的肽聚糖（含量低，少的肽聚糖（含量低，交联度疏松，交联度疏松，2-7nm），），外膜层为脂多糖、磷脂外膜层为脂多糖、磷脂和脂蛋白，约和脂蛋白，约8nm真菌真菌厚

10、厚25nm，占细胞干重的，占细胞干重的25%。分为三层：葡聚糖、。分为三层：葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质甘露聚糖和蛋白质方法：三轮冷冻与解冻液氮-196中冷冻5min，冰上0解冻15min液氮研磨称量反复冷冻超声破碎菌体研磨终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代谢组学解释代谢组学解释气质联用要求：沸点350，分子量1000，能完全气化，气化后对色谱柱和仪器无损伤（比如Ar、二氧化碳、水、甲醇、HCl和HNO3等）适用物质：主要是有机类小分子物质，包括烷，醇，胺，酯，醚，烯，酮，醛，羧酸，呋喃和吡啶衍

11、生物，异氰酸酯、异硫氰酸酯、硫化物和一些脂类。特点：测定的物质少（相对于液质）灵敏度高，精度高，适合测定nmol级的物质关键因素：分子量1000沸点350或者通过衍生化，能够具有挥发性（300成气态）胞内代谢物监测胞内代谢物监测-气质联用气质联用终止反应（淬灭）终止反应（淬灭）培养基与菌体分离培养基与菌体分离胞内代谢物提取胞内代谢物提取胞内代谢物监测胞内代谢物监测数据分析数据分析代谢组学解释代谢组学解释关键因素：分子量0-10,000胞内代谢物监测胞内代谢物监测-气质联用气质联用已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物的分析不适宜用气相色

12、谱分析，只能依靠液相色谱最终的实验方案最终的实验方案 淬灭与提取淬灭与提取5mL三轮冷冻与解冻液氮中冷冻5min，冰中解冻15min（地点：东配）发酵液（地点：东配）震荡2s25ml、-40的60%甲醇，5min40乙醇浴-9、3500rpm、离心5min5ml去离子水溶液4，离心3次-9、5000g、离心5min2ml、-30、50%的甲醇溶液-9、5000g、离心5min2ml冷甲醇水溶液(50% (vol/vol), 30 重新悬浮重新悬浮-9、5000g、离心5min-80储藏50%甲醇：4mL60%甲醇：25mL 1个2.63%NaCl:5mL-40乙醇浴容器：1个 -30乙醇浴容器：1个5mL移液枪、1mL移液枪普通冰盒：1个（提前装好冰）离心机需提前30min调节温度至-9-80冰箱需提前跟小闻老师协商以上试剂必须提前一天在对应的温度保藏测定菌体干重液氮称取称取5mg最终的实验方案最终的实验方案 衍生化衍生化-80储藏0.5ml1.5ml离心管0.3mg/ml （浓度231um/l）D4 succinic acid 50ul 1.5ml离心管震荡1min冷冻5min1.5ml离心管60ul（50ul）20mg/ml甲氧胺盐酸 30反应90min80ul MSTFA 37