5-DNA replication,mutation,injury and repair-2

1、第一节 DNA的复制一、DNA复制的一般特征二、原核生物的DNA复制三、真核生物DNA复制四、线粒体DNA复制五、噬菌体和病毒DNA的复制第四章 DNA的复制、突变、损伤和修复（一）单链环状DNA的复制过程单链环状DNA以滚环复制方式进行，如大肠杆菌噬菌体X174、M13、G等。现以X174为例说明。1. 第一阶段：单链环状DNA以亲本链（正链）为模板合成互补的环状负链，形成闭合的环状复制型（RF1）。RF1合成的引发首先由单链结合蛋白（SSB）结合到单链环上。基因FT TT AT AA.TA.TA.TA.TA.TG.CG.CG.CG.CG.CA.TA GG AC.GC.GC.GC.GA.TA

2、.T5TGATAAAAGATTCACTCTCACCTTATA.TGA.TTTTCTGCTTAGGAGTTTAATCATCTTTCAGACTTT3A CA GG.CG.CG.CA.TA AG.CG.CG基因GX174 pas发夹结构在F和G基因之间有一个不完整的回文结构（palindromes），形成两个发夹结构，此部分不与SSB结合。此结构称为pas site，即引发体组装位点（primosome assembly site），此结构与五种蛋白（priA，priB，DnaT，DnaB，DnaC）结合形成引发体。2. 第二阶段：通过成环滚环复制（looping rolling replicati

3、on）产生多个子代复制型（RF）。首先， 由噬菌体A基因编码的A蛋白（gpA）识别并结合到环状双螺旋DNA正链的复制原点，打开一个缺口，产生复制型（RF ），然后gpA的酪氨酸残基与5端核苷酸共价连接，保留磷酸二酯键打开释放的能量，接着，gpA，DNA螺旋酶和SSB共同参与DNA双螺旋解旋，形成复制叉。gpA使打开的正链5端形成环（loop），由大肠杆菌的DNA聚合酶以“”链为模板，在打开的正链3端合成一条不断循环的的正链，即为“滚环复制”（rolling circle replication）。（二）线状DNA的复制过程1. 双链线状DNA复制起始 线状DNA复制起始有两种类型：一种是从DN

4、A中间开始，如T7，另一种是从末端起始如腺病毒。T7噬菌体的复制起始：T7有39936bp，41个基因。有三个启动子PI、P、P，其中P起复制作用。T7的复制起始区位于基因1和基因1.1之间。T7DNA两端有“末端冗余”，还有一个基因4产物的识别位点3CTGGG5。 T7复制起始必需三个酶： T7 RNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，基因4蛋白（gene product 4，gp4）。 T7 RNA聚合酶（gp1）是基因1产物，是基因1.1直到最末尾的基因转录所不可缺少的。 基因4产物是多功能酶： 一是依赖单链DNA的核苷-5-三磷酸酯酶活性（dTTP酶活性最高）， 二是螺旋酶活性， 三是引发酶

5、活性。T7 DNA聚合酶由两个亚基组成：一个是T7的基因5蛋白（gp5 ），分子量为84kDa，单独存在时具有单链DNA35外切酶活性和进行下很低的聚合酶活性，聚合酶在催化1-50个脱氧核苷酸参入后即与模板脱离。另一个亚基是噬菌体诱导出来的寄主基因 trxA 编码的硫氧还蛋白（thioredoxin），分子量为12kDa。两个亚基结合后（1：1）成为具有很高进行性的DNA聚合酶，还具有单链、双链DNA的3 5外切酶活性。腺病毒复制的起始腺病毒DNA为线性双链，长度约3.6万bp。每个腺病毒DNA在5末端都共价连接了一个55kDa的蛋白质，称末端蛋白质（terminal protein），简称T

6、P。TP以丝氨酸羟基通过磷酸二酯键与5端的胞嘧啶共价连接。腺病毒两端有反向末端重复序列，长度介于103-162bp。在两末端各有50bp的区域为其两个复制点其中一个C-G碱基对和第9-18碱基对完全保守核因子NF1的结合位点也高度保守头25bp中有一段富含AT的区域，序列中AT占80%。保守序列NF1结合位点TP CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAG置换链 3 GTAGTAGTTATTATATGGAATAAAACCTAACTTCGGTTATACTATTACT C模板链腺病毒复制原点的序列起始过程：首先由寄主蛋白质-核因子NF1与D

7、NA结合；在72KDa的腺病毒单链DNA结合蛋白（DBP）和ATP共同存在下由TP催化使末端解链；140KDa的腺病毒DNA聚合酶催化80KDa的TP前体蛋白8（pTP）中的丝氨酸残基与dCTP5磷酸形成磷酸二酯键，反应除去一分子焦磷酸，形成pTP与dCMP的连接物； C与模板3端的G以氢键相结合形成起始复合物。dCMP游离的3-OH为DNA聚合酶延伸反应提供了引物复制起始复合体复制起始复合体 引发复制引发复制 （不需引物）（不需引物） 避免避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG 过程过程 SSB + ATP DNA 末端解链末端解链 TP pTP-Ser + dCT

8、P pTP-Ser-dCMP 3 OH2. 线性DNA复制的终止：线性DNA复制完成后，面临一个很严重的问题即当5端引物切除，因没有3-OH的存在，无法将缺少的一段补起来。这称5末端隐缩。T7噬菌体如何解决这一问题。T7噬菌体DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸称为末端冗余（terminal redundancy），两个子代分子中的单链末端可以互补。多余的单链部分可以被DNAase切去，然后再由DNA连接酶连接起来。1992年JD. Walson 提出了串联体假说。?二聚体二聚体3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌体体的的末末端端复复制制专一性核酸专一性核酸内切酶内切酶

9、3355335533553355互补的3端配对3535Pol I和连接酶封闭缺口35353553限制性酶交错切割35353535Pol I 3端延伸完成复制3. 单链线状DNA的复制啮齿动物中的一种微小病毒（parvovirus），其基因组是一条单链线状DNA。微小病毒一般含有4800bp，只编码三个蛋白。转录和复制所需的蛋白和酶系统都利用宿主细胞。微小病毒单链DNA的两端具有不同的反向重复顺序，可形成发夹结构。RepCapITRITRssDNA; inverted terminal repeats (ITR); Rep gene required for DNA replication; C

10、ap gene encodes capsid proteins(-)35abcdabfeghfeabcdab53e f ghfe efghf eabcdba(-)(-)(+)(+)(-)3553 abcdbae f ghfe efghf e(-)(+)abcdab53e f ghfe efghf e(-)(+)abcdba efghf e(+)feghfe(-)(-)(+)(三）逆转录病毒1. 逆转录病毒的复制： 逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒有三个基因：gag-编码核心蛋白；pol-编

11、码逆转录酶；env-编码被膜糖蛋白。 1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。 用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，底物为四种dNTP,并要求短链RNA作引物。 逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性； DNA指导的DNA

12、聚合酶活性； 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿53方向起核酸外切酶的作用； 无校对功能，错误率高，易产生变异。逆转录过程 a) tRNA与PBS结合，反转录 合成部分DNADNA负链 b) RNase降解病毒RNA5末端 c) 第一次跳跃 d) 负链DNA继续合成 e) RNA被降解，U3左边留下片段 作引物合成部分正链DNAf) 第二次跳跃正链DNA与负链 的另一端结合 g) 完成正链合成 LTR末端2. 逆转录病毒与疾病：大多数逆转录病毒造成的疾病都是比较慢性的，有些病毒虽然不直接导致疾病，但可以导致癌症，有些病毒可以在其基因插入细胞基因内而不导致疾病。在

13、人类进化的过程中有许多逆转录病毒将它们的基因插入人的基因内并成为人的基因的一部分。癌基因（oncogene）又叫转化基因（transforming gene）是人类或其他动物基因组中含有的一类基因。细胞癌基因（cellular oncogene， c-onc）原癌基因（proto-oncogene），未活化的c-onc。病毒癌基因（virus oncogene，v-onc）HIV病毒-引起艾滋病的病原体。人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。普遍认为，人类免疫缺陷病毒

14、的感染导致艾滋病（AIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome，“爱滋病”），艾滋病是后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重机会感染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病。自1983年发现（Luc Montagnier； Robert Gallo） ，HIV全球夺命2500万，死亡人数超过第一次世界大战，目前艾滋病病毒感染者尚有3300万人。HIV结构及生活史周期3. HIV与药物 核苷类似物：1985年发现几种核苷类似物（nucleoside analgues）能竞争性抑制HIV-1逆转录酶活性，并在逆转录中终止cDNA链的延伸。如3-叠氮脱氧胸苷（azidoth

15、ymidine, AZT)，1987年FDA批准上市的第一个治疗艾滋病有效药物。本品经细胞中酶的作用转化成活性型三磷酸齐多夫定，后者竞争性抑制HIV的逆转录酶，抑制其DNA的合成、运送和整合至宿主细胞核，而抑制病毒复制。 类似的还有双脱氧肌苷/胞苷（DDI/DDC）非核苷类似物：Nevirapine 和 Pyridinone 两者均可直接抑制HIV-1逆转录酶，对AZT耐药株有效；对HIV-2无作用，易产生耐药性。 HIV-1蛋白酶的抑制剂第二节 基因突变一、突变概念和类型（一）突变概念：突变(mutation)是指遗传物质发生的可遗传的变异。 没有发生突变的基因称为野生型(wild type

16、)基因。自然发生的突变称自发突变（spontaneous mutation）。物理或化学因素引起的突变称为诱发突变（induced mutation）；这些因素叫做诱变剂（mutagen）；由于突变剂的作用而产生突变的过程或作用称为突变生成作用（mutagenesis）。带有突变位点的基因称为突变基因（mutant gene）；带有突变基因的生物个体或群体称为突变体（mutant）。第四章 DNA的复制、突变、损伤和修复（二）突变类型：根据突变的原因和结果，可从多方面、多角度对基因突变进行分类。1. 碱基置换突变（base substitution mutation）；由于碱基对的置换或者一个

17、或多个碱基的增加或减少而引起的基因突变。根据DNA碱基序列的不同改变又可分为点突变、碱基插入、碱基缺失等。点突变：通常指碱基替代，点突变又可分为：单点突变（point mutation）和多点突变（multiple mutation）。可以分为转换（transitions）和颠换（transversions）两类。转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。碱基插入（base inseration）：通常指较长的碱基序列增加。有时插入序列本身携带遗传信息，如转座成分。转座成分的插入可使插入位点的基因失活，同时又带进新的基因。碱基缺失（base deletio

18、n）：通常指较长的一段碱基序列的缺少。缺失突变的回复突变率很低移码突变（frame shift mutation）：插入、缺失一个或两个碱基引起阅读框架的改变。移码突变可能产生新的终止密码，导致蛋白质合成过早终止。如果经突变造成蛋白质必需基因的改变，将使蛋白质功能丧失。根据对遗传信息的改变情况进行分类，可分为：同义突变（synonymous mutation）又称沉默突变（silent mutation）：由于密码子具有兼并性，单个碱基置换后未引起编码氨基酸变化，例如GCG的第三位G被A取代而成GCA，则mRNA中相应的密码子CGC就被转录为CGU，CGC和CGU都是精氨酸的密码子。 错义突变

19、（missense mutation）：是指DNA分子中的核苷酸置换后导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代。如镰刀贫血病，血红蛋白亚基多肽链的第6个氨基酸是谷氨酸，其mRNA分子正常编码为：GAA或GAG。如果基因正链上GAG中的一个碱基A变成T，即从GAGGTG，则其转录产物mRNA上密码子变成了GUG，GUG是代表缬氨酸。这样谷氨酸被缬氨酸取代。无义突变（nonsense mutation）：当单个碱基置换导致出现终止密码子(UAG、UAA、UGA)时，多肽链将提前终止合成，所产生的蛋白质(或酶)大都失去活性或丧失正常功能。例如，DNA分子模板链中ATG的G被T代替时，相应的mR

20、NA上的密码子便从UAC变成终止信号UAA，因此翻译便到此为止，使肽链缩短。4. 根据突变表现型对外界环境的敏感性分类非条件性突变（nonconditional mutation）条件性突变（conditional mutation）根据研究目的选择一定的条件，使细胞产生一定的突变，但能正常生长或近乎正常。最常用的条件是温度，因为温度宜控制，所以最常见的条件型突变为温度敏感突变（temperature sensitive mutation）5. 从突变效应背离或返回到野生型可分为：正向突变（forward mutation）指由野生型变为突变型是正向突变。 回复突变（backmutation

21、or reverse mutation），回复到野生型的突变。6. 影响基因调控序列：突变位点可能存在于负责基因调控的DNA序列中。如突变位点在启动子区域，则有可能造成启动子上升突变（promoter up mutation）或下降突变（ promoter down mutation）。如果突变位点发生在操纵子（operator），使操纵子的阻遏蛋白结合位点发生突变，则不能结合阻遏蛋白或突变发生在调节基因上使其不能产生有功能的阻遏蛋白。突变位点位于操纵子或调节基因的突变造成的两种结果都使结构基因失去了负向控制，使细胞不能根据需要来控制蛋白质生成，即细胞产生不依赖于需要的，有固定数量的蛋白质；基

22、因的这种表达方式叫组成型表达。产生这种表达方式的操纵子突变或调节基因的突变叫做组成型突变（constitutive mutation）。启动子突变体和组成型突变体是研究基因调控的重要手段。二、突变原因（一）自发突变(spontaneous mutation)， 自然发生的，无人为干扰的突变。引起自发突变的因素主要有DNA复制中的错误和DNA自发的化学改变。 DNA复制错误：如A与C配对，这样在复制时将产生该位点为A-T与G-C配对的两条子链。由于碱基自身存在互变异构体，可能形成错误的碱基配对。1. 自发的化学变化：最常见的是脱嘌呤（depurination）和脱氨基（deamination）D

23、NA复制错误 ATGTCTACAGATGTC AT A TCTA TAGTA TAGATGTC TACAG ATGTC TACAG ATGTCTACAG ATGTCTACAG 新链 5 3 A G T TT C A A A A A C G 模板链 3 5 新合成链环出 5 3 5 T 3 A G T T A G T T T TT C A A A A C G T C A A A A A C G 3 A 5 3 5 模板链环出 新链上插入一个碱基 新链上缺失一个碱基 5 3 5 T 3 A G T T T T G C A G T T T T T G CT C A A A A C G T C A A

24、 A A A C G 3 A 5 3 5 图214 在 DNA 复制中由于 DNA 的错误环出自发产生碱基的插入和缺失 (参考 Peter J. Russell: Genetics, 3rd ed.,Fig18-8)脱嘌呤作用：指在DNA双螺旋链上脱氧核糖和嘌呤之间的糖苷键断裂，A或G被切下，成为无嘌呤位点。脱氨基作用：DNA双链的碱基上去除氨基，如胞嘧啶上有一个易被氧化的氨基，该氨基变成羰基（去氨基）后，该位点上嘧啶变成了尿嘧啶。如果DNA中有“U”未被细胞的DNA修复系统除去，那么当该突变的DNA复 制时，子链在该位点将加上一个A与之配对，结果本应是C-G对转变成了T-A对，产生了碱基转换

25、突变。4. 氧化作用损伤碱基（oxidatively danaged bases）：细胞代谢产生的一些活性氧集团，如过氧化物（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟基(-OH)等，可使DNA氧化损伤，从而导致突变。如胸苷氧化后产生胸苷乙二醇，G氧化后产生8-氧-7，8二氢脱氧鸟嘌呤或8-氧鸟嘌呤（8-O-G，GO），GO可与A错配，导致G-CT-A突变。利用诱变剂增加突变率1. 射线：包括紫外线、X射线、射线及宇宙射线等。UV是所有病毒和细菌的诱变剂。由于DNA中的嘌呤和嘧啶的杂环有很强的吸收254-260UV的能力，所以这种波长的UV能引起DNA碱基变化，造成DNA突变。主要是引起相邻的两个T形

26、成二聚体。TT的紧密连接引起双螺旋变形，从而阻断转录并暂时阻断DNA复制，引起细胞死亡。（二）诱发突变（induced mutation）X、和宇宙射线是离子化射线。当射线作用于组织时，产生具有高度反应性的自由基。引起DNA损伤。DNA损伤包括三种效应：DNA链戊糖和磷酸组成组成的骨架被破坏，造成单链断裂；双链断裂核苷酸碱基改变。2. 化学诱变剂 碱基类似物：是一类化学结构与DNA中正常碱基十分相似的化合物。通常指人工合成的，如嘌呤类似物有8-吖鸟嘌呤，6-巯基嘌呤，二氨基嘌呤；嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶，5-氟尿嘧啶等。如5-溴尿嘧啶和T很相似，仅在第5个碳元子上由Br取代了甲基 5-BU有，

27、酮式，烯醇式两种异构体，可分别与A及G配对结合 A A G GT BUK BUE C酮式 烯醇式氨基嘌呤（2-aminopurine，2-AP）：也是碱基类似物。它也有二种互变形式，一种是正常状态，另一种是稀有形式状态，以亚胺形式存在。前一种可与DNA双链中原来的A-T配对，转成C-G配对或原有的G-C对变成A-T对。A 2AP 2AP* GT T C C亚硝酸：使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。 可使G第二个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine，X），黄嘌呤仍能与C配对，故不产生碱基转换。但若C和A脱氨后分别

28、产生U和次黄嘌呤(H)，U与A配对， H与C配对，使C-G转换成A-T或A-T转换成G-C； 碱基修饰剂HNO2AH G G A AT C C C U THNO2 羟胺：只能特意地和胞嘧啶（C）起反应。在C上第4个碳原子加-OH，该产物可和A配对使G-C转换成T-A；HA C 4-OH-C TG A A 烷化剂：一类使碱基烷基化的化合物，如甲基磺酸乙酯（EMS）、氮芥（NM）、甲基磺酸甲酯（MMS）、亚硝酸胍（NG）等。EMS使G第6位烷基化，使T第4位上甲基化，产生O-6-E-G和O-6-E-T。两者分别和T，G配对，是原来的G-C对转变成A-T对，A-T转变为G-C。GO-6-E-G A

29、T O-4-E-T CCT T A G G DNA插入剂：又称插入突变剂（intercalating mutagens），包括原黄素（proflavin）、丫啶橙（acridine orange）、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓（ethidium bramide）和ICR的复合物等。 (a) 增加碱基 插入剂分子 模板链 5ATCAG TTACT3 新合成链 3TAGTC G AATGA5 068nm 随机选择碱基 嵌入插入剂处 下一轮复制 5ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失碱基 模板链 5ATCAG T TACT3 新合成链 3TAGTC

30、 ATGA5 插入剂失去 后复制 插入剂 5 ATCAGTACT 3 3 TAGTCATGA 5 图21-15 插入突变导制碱基的增加(a)和减少 (b) （三）基因的人工诱变：1. 体外定向突变的方法：有目的地进行选择性DNA突变。1985年加拿大的Michael Smith建立，于1993年获得了诺贝尔化学奖。具体方法有三种：（1）聚核苷酸介导的用单链模板定点突变；（2）双引物法定点突变；（3）用掺入U的单链为模板进行聚核苷酸介导的体外定点突变。三种方法产生定点突变的原理是一样的。举例如下：先合成一条包括被替代的靶碱基及附近序列的一段寡核苷酸，这条寡核苷酸除被替换的靶碱基，其余的序列与野生

31、型DNA分子中的相应序列完全一致。将待研究的DNA克隆变性后插入到单链噬菌体（如M13）DNA中。将合成的寡核苷酸与单链噬菌体中DNA克隆的互补单链进行杂交。以寡核苷酸做引物，DNA克隆的互补单链做模板，在DNA聚合酶I Klenow片段的作用下合成完整的互补链，再用DNA连接酶连接起来，将此双链DNA导入大肠杆菌中，经修复和DNA复制就可以得到可稳定遗传的突变DNA克隆。例如将干扰素的第17位氨基酸Cys变为Ser，Cys的密码子为TGT而Ser的密码子为AGT，因此只需改变一个碱基对。ACAAGTTCATGAACTTGAACATGA2. 体外定点突变的应用体外定点突变技术是研究蛋白质结构和

32、功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。如：将胰高血糖素第21位的氨基酸天冬氨酸突变为丙氨酸，研究胰高血糖素结构与功能的变化：研究组蛋白脱乙酰化酶1（HDAC1）保守氨基酸中组氨酸的定点突变对其功能的影响 研究人血红蛋白99、82位点突变，与血红蛋白四聚体稳定性的关系。（四）适应性突变1988年凯恩斯等人于英国著名的Nature上，发表了一篇名为，The origin of mutants的文章， 发现了适应性突变。凯恩斯所用的大肠杆菌的lacZ基因（其产物为半乳糖 ，可分解乳糖为葡萄糖和半乳糖）带有一个点突变，称为琥珀突变（amber mutation），这样的突

33、变会使得lacZ基因产物转译（translate）不完全，故其产物会失去正常分解乳糖的功能除非有突变发生，使得lacZ的产物能完全转译，否则带有这种基因的大肠杆菌便无法生长在以乳糖为唯一碳源的培养平板上。凯恩斯的实验结果可得到两个重要的结论乳糖可诱使Lac +突变种持续产生，而不是因为饥饿所导致； 乳糖诱使细菌产生特定方向的突变，也就是乳糖只会诱使大肠杆菌的LacZ基因产生突变，而不影响其他的基因。 三、突变体的分离与分析（一）突变体的分离： 分子生物学研究中，基因突变可以在体外按照人们的设计进行，但是仍然有很多不需要的突变体，因此需要分离，方法有：利用遗传分析方法，筛选、选择、富集需要的突变

34、体，常见的例子是利用抗性基因，使带有抗性基因的突变体可以生长，其它被杀死。（二）突变体的分析：遗传检测法1. 根据重组载体的抗药性标志筛选：如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生

35、长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 -半乳糖苷酶法载体含有lacZ的蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种利用蓝色化合物作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。主要是在载体的非必要区插入一个大肠杆菌-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。携带lacZ 的载体转入lac-的宿主菌后，在含有X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)平板上可形成蓝色菌落。外源基因插入lacZ（或lacZ被取代）后，重组子将丧

36、失分解X-gal的能力。转入lac-的平板上可形成白色菌落。 2. 核酸杂交法：利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是Southern 印迹杂交和斑点杂交等。将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。3. PCR技术（见书）四、突变与人类疾病突变基因改变了原有的结构与功能，导致原有的遗传性状发生改变，其中一部分基因突变可导致遗传病或具有遗传倾向的病甚至肿瘤。如血友病是凝血因子基因的