4第四章 目的基因的制备1

1、第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备为使优良性状聚集于同一生物体，在生物为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的群体中分离其编码蛋白（酶）的结构基因结构基因，创造出有价值的新物种。创造出有价值的新物种。生物界的长期进化积累了大量对人类有用生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。的基因，这是一个宝贵的资源。目的基因目的基因从现有的生物群体中，根据从现有的生物群体中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。需要分离出用于克隆的此类基因。 第一节第一节 目的基因目的基因第二节第二节 目的基因的制备目的基因的制备目前目的基因的获取方法主要有以下目前目的基

2、因的获取方法主要有以下2 2类：类：（1 1）已知基因的获得：）已知基因的获得：PCRPCR分离法分离法 化学合成法等化学合成法等（2 2）未知基因的获得：）未知基因的获得：直接分离法直接分离法 基因文库分离法基因文库分离法 （基因组文库和（基因组文库和cDNAcDNA文库）等文库）等（1）限制性核酸内切酶酶切分离法）限制性核酸内切酶酶切分离法一、直接分离法一、直接分离法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。切成不同大小的片段。应用对象应用对象适用于从适用于从简单的基因组简单的基因组中分离目的基因，如质粒或中分离目的基因，如质粒或病毒。病毒。已定位：已定位：根据

3、目的基因两侧的已知的酶切位点，一次就可以根据目的基因两侧的已知的酶切位点，一次就可以获得。获得。已定序：已定序：只需要用已知序列的限制性内切酶进行一次或者多只需要用已知序列的限制性内切酶进行一次或者多次酶切，分离纯化所需的次酶切，分离纯化所需的DNA片段，与适当载体连接。片段，与适当载体连接。未定序或无定位未定序或无定位：也只需酶切分析，随后再通过部分酶切，：也只需酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，然后钓出目的基因。构建一个简单的基因文库，然后钓出目的基因。优点优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点缺点目的基因易被切碎。

4、目的基因易被切碎。（2 2）基因分离的物理化学法）基因分离的物理化学法基本原理：基本原理： A=TA=T和和G CG C之间之间氢键氢键的差异，导致不同基因片的差异，导致不同基因片段的碱基组成差异较大，其段的碱基组成差异较大，其理化性质理化性质如浮力密度如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即到和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即到达分离的目的。达分离的目的。密度梯度离心法密度梯度离心法（富含（富含GCGC的片段浮力密度大，使的片段浮力密度大，使用精密的密度梯度超速离心技术）用精密的密度梯度超速离心技术） 单链酶解法单链酶解法（富含（富含GCGC的片段的片段TmTm高）高）分子杂

5、交法分子杂交法分子杂交法缺点：缺点： 仅在理论上有重要意义，在实践上很难应用仅在理论上有重要意义，在实践上很难应用密度梯度离心法密度梯度离心法单链酶解法单链酶解法分子杂交法分子杂交法物理化学法物理化学法富含富含GCGC的片段浮力密度大的片段浮力密度大富含富含GCGC的片段的片段TmTm高高碱基互补配对碱基互补配对非洲爪蟾非洲爪蟾5SDNA海胆海胆DNA大肠杆菌乳糖操纵大肠杆菌乳糖操纵子的子的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（3 3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因 原理：原理：抗原、抗体结合抗原、抗体结合适用范围：适用范围：适于分离某一真核蛋白质已被分离纯适于分离某一真核蛋

6、白质已被分离纯化，且足以产生特定抗体的基因。化，且足以产生特定抗体的基因。适用范围：适用范围：主要用于合成分子质量较大，转录产物主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离的目的基因。易分离的目的基因。原理：原理：分离出目的基因的分离出目的基因的mRNA,再经再经RTPCR合合成成cDNAmRNA cDNA dscDNA（4 4）酶促反转录法直接从特定）酶促反转录法直接从特定mRNAmRNA分离基因分离基因二、构建基因组文库分离法二、构建基因组文库分离法高等真核生物：高等真核生物：基因组基因组DNADNA十分庞大，基因可达数万个；十分庞大，基因可达数万个；基因组成结构复杂基因组成结构复杂单

7、个目的基因在整个基因组中所占的比例及其微小。单个目的基因在整个基因组中所占的比例及其微小。绝大多数基因难以直接分离得到。绝大多数基因难以直接分离得到。基因扩增（无法对未知的单个目的基因特异扩增，基因扩增（无法对未知的单个目的基因特异扩增，只能对所有基因扩增）只能对所有基因扩增）构建该生物材料的基因组文库构建该生物材料的基因组文库根据不同方法将所需的克隆筛选出来，根据不同方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因最后分离得到目的基因 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目过快速有效的筛选程序从众多克

8、隆中分离出含有目的基因的的基因的目的重组子目的重组子，进而获得目的基因。，进而获得目的基因。克隆目的基因的基本战略克隆目的基因的基本战略1.1.使用限制性内切酶将带使用限制性内切酶将带有有目的基因目的基因的的DNADNA链切成若链切成若干小段。干小段。2.2.再使用再使用DNADNA连接酶将其整连接酶将其整合到合到质粒载体质粒载体的基因中的基因中, ,并并转化受体细胞转化受体细胞使其表达。使其表达。3.3.如果在某个细胞中得到如果在某个细胞中得到了了目的产物目的产物, ,就说明整合到就说明整合到该细胞中的该细胞中的DNADNA片段就是所片段就是所需要的需要的DNADNA片段。片段。 鸟枪法步骤

9、鸟枪法步骤 1999 年年 12 月月用用“逐个克隆法逐个克隆法”获得第一条人类染获得第一条人类染色体色体 22号染色号染色体完成序列体完成序列 2000 年年3 月月用用“全基因组全基因组鸟枪法鸟枪法”获得获得果蝇全基因组果蝇全基因组序列。序列。v 中国科学院中国科学院2004年年12月月 9日在北京宣布，国际日在北京宣布，国际鸡鸡基因组计划基因组计划取得重大成取得重大成果：利用经济、快速、果：利用经济、快速、高效的测序方法高效的测序方法“鸟鸟枪法枪法”，我国科学家不，我国科学家不仅和国际同行共同绘制仅和国际同行共同绘制出以出以红原鸡红原鸡为对象的鸡为对象的鸡基因框架图谱，而且领基因框架图谱

10、，而且领衔绘制出了乌鸡、肉鸡、衔绘制出了乌鸡、肉鸡、蛋鸡等四种不同鸡种之蛋鸡等四种不同鸡种之间的遗传差异图谱。间的遗传差异图谱。 的鸟枪法测序的优缺点的鸟枪法测序的优缺点优点：优点：操作简便、快速操作简便、快速 缺点：缺点：l质粒质粒容纳外源容纳外源DNADNA片段的长度有限（片段的长度有限（7-10kb7-10kb）l随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加增加工作量工作量，有一定的，有一定的盲目性盲目性l高等真核生物（如人类高等真核生物（如人类）基因组中有大量）基因组中有大量重复序重复序列列，导致判断失误。，导致判断失误。适用于适用于原核细菌

11、目的基因原核细菌目的基因的克的克隆分离隆分离 u 用克隆载体将某种生物的基因组全部遗用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的这种生物的基因组文库基因组文库。u 若只储存某生物基因组的部分遗传信息，若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成即构成部分基因组文库部分基因组文库。1、基因组文库的定义、基因组文库的定义基因组文库的优缺点：基因组文库的优缺点：v 对于对于原核和低等真核细胞原核和低等真核细胞，基因结构比较简单，基因组文，基因结构比较简单，基因组文库可作为直接提供基因工程所需的各种目的基因的重要来库可作为直接提

12、供基因工程所需的各种目的基因的重要来源。源。v 较高等的真核细胞较高等的真核细胞，尤其是人和哺乳动物细胞，基因结构，尤其是人和哺乳动物细胞，基因结构较为复杂，一个结构基因往往可被数个插入序列所间隔，较为复杂，一个结构基因往往可被数个插入序列所间隔，因此从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体因此从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的表达研究。但它们对真核细胞基因结构的分析、基因外的表达研究。但它们对真核细胞基因结构的分析、基因表达和调控的研究有着重要作用。表达和调控的研究有着重要作用。N=基因组基因组DNA总长总长/DNA插入片段的平均长插入片段的平均长 2、基因组文库的大小

13、、基因组文库的大小如如:人基因组人基因组DNA总长度为总长度为3109bp，酶切，酶切后的后的DNA片段平均长为片段平均长为15kb，那么这个基，那么这个基因组文库要多大？因组文库要多大？N=3109/15103=2105实际上该基因组文库应含的克隆子实际上该基因组文库应含的克隆子数远远超过这个数。数远远超过这个数。经验公式：经验公式：N=ln( 1-P )/ln( 1-f )N：文库必需的克隆数：文库必需的克隆数 P：文库中目的：文库中目的DNA片段的出现概率片段的出现概率 f：插入片段大小：插入片段大小/全基因组大小的比值全基因组大小的比值例如：从人基因组例如：从人基因组DNA（总长度为（

14、总长度为3109bp）的文）的文库中筛选到长约库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？那么这个基因组文库要多大？ In（10.99） N = = 9.2105 In （11.51033109）v为了使基因组文库具有真实代表性，一般构建基因为了使基因组文库具有真实代表性，一般构建基因组文库的实际克隆数应比上述计算值组文库的实际克隆数应比上述计算值大大2 2倍或倍或3 3倍倍，甚至更高。甚至更高。获得含基因的获得含基因的DNA片段片段与与噬菌体克隆载体重组噬菌体克隆载体重组转化受体菌并筛选重组子（见导入受体细转化受体菌并筛选重组子（见导入受体细胞

15、第五章）胞第五章）3 3、构建、构建噬菌体基因组文库的步噬菌体基因组文库的步骤骤优点优点: :比比噬菌体容纳的外源噬菌体容纳的外源DNADNA大大(30(3045kb),45kb),构构建完整文库所需克隆数少建完整文库所需克隆数少; ; 载体仅约载体仅约5kb,5kb,可直接分析插入片段的限制可直接分析插入片段的限制性图谱性图谱, ,而而噬菌体则否噬菌体则否. .4、构建考斯质粒基因组文库、构建考斯质粒基因组文库缺点缺点 : 难筛选难筛选;（菌落原位杂交的敏感度低于噬菌斑的原位杂交）（菌落原位杂交的敏感度低于噬菌斑的原位杂交） 重组效率低重组效率低(噬菌体载体噬菌体载体1056考斯质粒考斯质粒

16、1045 clongs/gDNA); 不易储存（噬菌斑可无限期贮藏；细菌菌落贮藏后，细菌不易储存（噬菌斑可无限期贮藏；细菌菌落贮藏后，细菌成活率下降）成活率下降）基因组文库的构建过程基因组文库的构建过程: 酶解制备外源酶解制备外源DNA; 酶切载体酶切载体; 连接重组并包装进噬菌体连接重组并包装进噬菌体;重组体转染宿主菌。重组体转染宿主菌。机械断裂法（物理）机械断裂法（物理） 用用超声波超声波或或高速搅拌高速搅拌DNADNA溶液溶液制备全部基因组的制备全部基因组的DNA片断片断缺点：缺点：断裂片段末端往往具有一个序列未知的短断裂片段末端往往具有一个序列未知的短的核苷酸片段，没有与克隆载体匹配的

17、粘末端的核苷酸片段，没有与克隆载体匹配的粘末端, , 因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用300bp片段片段1500r/min，30min8kb分子群体分子群体限制性核酸内切酶降解限制性核酸内切酶降解(化学化学)例如：用例如：用EcoRIEcoRI，它所产生的，它所产生的DNADNA限制片段的平均长限制片段的平均长度为度为4kb4kb左右。左右。存在问题：存在问题： 一个完整的基因（特别是一种大分子量的基因）一个完整的基因（特别是一种大分子量的基因）有可能会被有可能会被EcoRIEcoRI限制酶从其编码区段内切割一次甚限制酶从其编码区段内切割一次甚至

18、多次。即，至多次。即，不能以单一片段的形式获得一个完整不能以单一片段的形式获得一个完整的基因的基因。因此，平均长度为。因此，平均长度为4kb4kb的的EcoRIEcoRI限制片段确限制片段确实太短了。实太短了。 目的基因可能被包容在一个其目的基因可能被包容在一个其大小超出载体分子大小超出载体分子承载能力承载能力的的DNADNA片段上，这个基因将可能从基因文库片段上，这个基因将可能从基因文库中遗漏掉。中遗漏掉。解决方案：解决方案：v用特异性识别用特异性识别4 4个核苷酸的酶，可得到一整套长个核苷酸的酶，可得到一整套长约约20kb20kb（噬菌体载体容纳能力最高为（噬菌体载体容纳能力最高为22kb

19、22kb）的片）的片段。段。原因：原因：有有n n个核苷酸的识别序列出现的概率个核苷酸的识别序列出现的概率1/41/4n n， 1/41/44 4=1/256=1/256， 1/41/46 6=1/4096=1/4096，哺乳动物细胞染色体，哺乳动物细胞染色体DNADNA含含3 310106 6kbkb，欲得到长度为，欲得到长度为20kb20kb的片段，需采的片段，需采用有用有4 4个核苷酸的识别序列的限制性核酸内切酶（个核苷酸的识别序列的限制性核酸内切酶（切割频率较高切割频率较高，如，如Sau 3ASau 3A）进行）进行部分消化部分消化。随机性随机性GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：如：Sau 3A识别识别 ： GATC BamH识别识别 ： GGATCCGATCCTAGCTAGGATC Sau 3Av断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。可以直接与处理过的载体连接。切割基因组DNA处于载体上对载体的要求对载体的要求载体能容载的载体能容载的DNADNA片段大小直接影响到构建完整的基片段大小直接影响到构建完整的基因组文库所需的