8.蛋白质的分离纯化-王镜岩生物化学(全)

1、第第 七七 章章 蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化和表征和表征 研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。的蛋白质样品。 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：蛋白质之间各种特性的差异，包括：1.分子的大小和形状、分子的大小和形状、2.酸碱性质、酸碱性质、3.溶解度、溶解度、4.吸附性质吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。对配体分子的特异生物学亲和力。 第一节第一节 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋白质的等电

2、点蛋白质的等电点n蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端留着游离的末端氨基和氨基和羧基以及侧链上羧基以及侧链上的各种功能团。的各种功能团。蛋白质也是一类两性电解质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团链上的功能团 .n对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一这一pH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点（与蛋白质所含（与蛋白质所含氨基酸种类有关

3、）。氨基酸种类有关）。n蛋白质的蛋白质的等离子点等离子点是特征常数是特征常数 蛋白质的蛋白质的电泳电泳n在等电点时在等电点时(Isoelectric point pI)(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。n在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质环境下，蛋白质的电学性质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现正

4、电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为象称为蛋白质电泳蛋白质电泳( (ElectrophoresisElectrophoresis) )。电泳电泳n利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。第二节第二节 蛋白质分子大小的蛋白质分子大小的测定测定常用测定方法：常用测定方法：1、根据化学组成测定最低相对分子质量、根据化学组成测定最低相对分子质量2、凝胶过滤法测定相对分子质量、凝胶过滤法测定相对分子质量3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量分子质量4、渗透压法、渗透压法5、沉降分析法（离心）、沉降分析法（离心）

5、一、根据化学组成测定最低相对分子一、根据化学组成测定最低相对分子质量质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质的最低相对分子质量。质的最低相对分子质量。例如，肌红蛋白含铁量为例如，肌红蛋白含铁量为0.335，其最低，其最低相对分子质量可按下式算出：相对分子质量可按下式算出：最低相对分子质量最低相对分子质量= （铁的原子量（铁的原子量/铁的百铁的百分含量）分含量）X 100=（55.8/0.335）X100=16700二、凝胶过

6、滤法测定相对分子质量二、凝胶过滤法测定相对分子质量n凝胶过滤原理凝胶过滤原理分子筛色谱分子筛色谱（凝胶过滤）（凝胶过滤）利用利用Andrews的实验经验式：的实验经验式： logMr = a/bVe/bVoVe（elution volume）为某一溶质组分的洗脱）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。（峰顶）出现时所流出的体积。 V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝

7、色葡聚糖凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖2000的洗脱体积可以决定的洗脱体积可以决定V0。 logMr三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量法测定相对分子质量 聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而共聚而成）为支持物成）为支持物 。 蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的率决定于它所带的电荷以及分子大小和形状电荷以及分子大小和形状

8、(电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应)。 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)和少量巯基乙醇，和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时此时SDSSDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。复合体。结果：结果：1 1、所有的所有的SDS-SDS-蛋白质复合体蛋白质复合体都具有相同的荷质比。都具有相同的荷质比。2 2、具有相同的构象。具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要因此蛋白质分子的电泳迁移率主要

9、取决于它取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。子形状无关。 十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区） 在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子分子筛效应筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量的，电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系：对数有下列关系： log Mr = abR式中式中Mr为相对分子质量，为相对分子质量，a、b都是常数，都是常数，R是相对迁移率：是相对迁移率： R = 样品迁移距离样品迁移距离/前沿（染料）迁移距前沿

10、（染料）迁移距离离 实验测定时，以几种相对分实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的子质量标准物蛋白质的Mr的对的对数值对其数值对其R值作图，根据待测样值作图，根据待测样品的品的R,从标准曲线上查出它的从标准曲线上查出它的Mr。最准确可靠的方法是最准确可靠的方法是超离心法超离心法（Svedberg于于1940年设计）：蛋白质颗粒在年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离离心力作用下从溶液中沉降下来。心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（沉降系数（s）：）：单位（单位（cm）离心场里的沉降速度。）离心场里的沉降速度。 s = v2x v =沉降速度（沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速

11、度（弧度离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的蛋白质界面中点与转子中心的距离（距离（cm）沉降系数的单位常用沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）蛋白质分子量（蛋白质分子量（M）与沉降系数（）与沉降系数（s）的关系）的关系M = RTsD（1V）R气体常数（气体常数（8.314107ergsmol -1 度度-1）T绝对温度绝对温度D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（溶剂密度（20，gml-1） s沉降系数沉降系数第三节第三节

12、 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀一、蛋白质的胶体性质一、蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散程度而言蛋白质溶液程度而言蛋白质溶液属于胶体系统。属于胶体系统。分散相质点在分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备胶体系统中保持稳定应具备三个条件：三个条件：A A、分散相的质点大小在分散相的质点大小在1-100nm1-100nm范围范围内。动力学上稳定，能作不断的布朗内。动力学上稳定，能作不断的布朗运动。运动。 真溶液（真溶液（1nm1nm） 胶体溶

13、液胶体溶液 悬浮液悬浮液(100nm(100nm）B B、分散相的质点带有同种电荷，互相分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀。排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀。C C、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层（如水化层）层（如水化层）蛋白质蛋白质溶液性质：溶液性质：1 1、蛋白质分子颗粒在、蛋白质分子颗粒在1-100nm1-100nm范围内范围内。2、形成水化层：、形成水化层：分子表面上亲水基团在分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用水溶液中能与水分子起水化作用3、构成稳定的双电层：、构成稳定的双电层：分子表面上的可分子表面上的可解离基团，在适

14、当的解离基团，在适当的pH条件下，都带条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。成稳定的双电层。+-+4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有一样具有丁达尔效应、布朗运动以丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜及不能通过半透膜等性质等性质 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用膜，因此可以应用透析法透析法将非蛋白的小分将非蛋白的小分子杂质除去。子杂质除去。二、蛋白质的沉淀二、蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性蛋白质在溶液中的稳定性与它的分与它的分子量大小、所带的电

15、荷和水化作用子量大小、所带的电荷和水化作用有关，有关，是有条件的、相对的。如果是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。淀出来。n在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。n在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。溶液，所以这种沉淀又称为非变性

16、沉淀。n可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。法等。n在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。可能再重新溶解于水。n由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。质的变化，所以又称为变性沉淀。n如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉

17、淀、重金属盐沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。淀。沉淀蛋白质的方法有以下几种：沉淀蛋白质的方法有以下几种：(1) 盐析法盐析法 ： 向蛋白质溶液中加人大量向蛋白质溶液中加人大量的中性盐的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，又可溶解。后，又可溶解。 (2) 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 极性有机溶剂极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等甲醇、乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电因引起蛋白

18、质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。(3) 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 (4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法 (5) 加热变性沉淀法加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处蛋白质处于等电点也破坏了带电状态（当处于等电

19、点时）。于等电点时）。 少量盐类促进蛋白质的加热凝固。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。（豆腐）我国很早就创造了将大豆（豆腐）我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤卤(含含MgCl2)的制豆腐的方法，这是的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。一个例子。 n点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许点卤时，由于盐卤是电解质，它们在水里会分成许多带电的小颗粒多带电的小颗粒正离子与负离子，由于这些离正离子与负离子，由于这些离子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致没有足子的水化作用而夺取了蛋白质的水膜，以致

20、没有足够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了够的水来溶解蛋白质。另外，盐的正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋由于蛋白质表面所带电荷而引起的斥力，这样使蛋白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时，白质的溶解度降低，而颗粒相互凝聚成沉淀。这时，豆浆里就出现了许多白花花的东西了。豆浆里就出现了许多白花花的东西了。盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，盐卤里有许多电解质，主要是钙、镁等金属离子，它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了它们会使人体内的蛋白质凝固，所以人如果多喝了盐卤，就会有生命危险。盐卤，就会有生命危险。 第四节第四节 蛋白质分离纯化的蛋白质

21、分离纯化的一般原则一般原则 分离纯化某一特定蛋白质的分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为：一般程序可以分为： 1、前处理、前处理 2、粗分级、粗分级分离分离 3、细分级、细分级分离分离 1、 前处理前处理 (pretreatment) n分离纯化某一分离纯化某一蛋白质蛋白质，首先要求把蛋白质从原，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。保持原来的天然状态，不丢失生物活性。n动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，n种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污种子材料应

22、先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。醚等脱脂。n然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。织和细胞破碎。n动物动物组织和细胞可用电动组织和细胞可用电动捣碎捣碎机或机或匀浆匀浆器破碎器破碎或用或用超声波超声波处理破碎。处理破碎。n植物植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨研磨的方

23、的方法破碎，液氮破碎或用法破碎，液氮破碎或用纤维素酶纤维素酶处理也能达到处理也能达到目的。目的。n细菌细菌细胞的破碎的常用方法有细胞的破碎的常用方法有超声波超声波震荡，与震荡，与砂砂研磨研磨、高压挤压高压挤压或或溶菌酶溶菌酶处理处理(以分解肽聚以分解肽聚糖糖)等。等。n组织和细胞破碎以后，选择适当的组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液缓冲液把所把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。心或过滤等方法除去。 n如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质如细胞

24、核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开等，则可利用差速离心方法将它们分开如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。然后用适当的介质提取。2、 粗分级分离粗分级分离 (rough fractionation) n当蛋白质提取液当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。质与其他杂蛋白分离开来。

25、n一般这一步的分级分离用一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀盐析、等电点沉淀和和有机溶剂有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质简便、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱包括脱盐盐)，又能浓缩蛋白质溶液。，又能浓缩蛋白质溶液。n有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用或盐析法浓缩，则可采用超过滤、冷冻真空干超过滤、冷冻真空干燥燥或其他方法或其他方法(如如聚乙二醇聚乙二醇浓缩法浓缩法)进行浓缩。进行浓缩。3、 细分级分离细分级分离 (fine fractionation)

26、 进一步纯化，一般使用进一步纯化，一般使用层析法层析法包括凝胶包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择和层析等。必要时还可选择电泳法电泳法，包，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。模较小，但分辨率很高。 4、 结晶结晶 n结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均

27、一的，但只有某种蛋白质在溶保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。液中数量上占优势时才能形成结晶。n由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标然状态的有力指标。n结晶也是进行结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。 第五节第

28、五节 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法 几种常用的蛋白质纯化方法：几种常用的蛋白质纯化方法：根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：质的方法：分子大小；分子大小；溶解度；溶解度；电荷；电荷；吸附性质；吸附性质；对配体分子的生物学亲和力等。对配体分子的生物学亲和力等。 一、根据分子大小不同的纯化方法一、根据分子大小不同的纯化方法 n1透析和超过滤透析和超过滤 透析透析(dialysis)是利是利用蛋白质分子不能用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、分子物质如无机盐、单糖等分开。常用单

29、糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维和其他改型的纤维素材料。素材料。 超滤超滤是利用压是利用压力或离心力，强行力或离心力，强行使水和其他小分子使水和其他小分子溶质通过半透膜，溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。和脱盐的目的。2密度梯度密度梯度(区带区带)离心离心 n蛋白质颗粒在具有密度梯蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质到与自身

30、密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带，中被分离成独立的区带， 密度梯度密度梯度n常用的密度梯度有蔗糖常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。梯度，聚蔗糖梯度。n蔗糖便宜，纯度高，浓蔗糖便宜，纯度高，浓溶液溶液(60，WW)密度密度可达可达1.28 gcm3。n聚蔗糖的商品名是聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和它是由蔗糖和1氯氯2，3环氧丙烷合成的高聚环氧丙烷合成的高聚物，物，Mr约约400 000。n密度梯度在离心管内的密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，分布是管底的密度最大，向上逐渐减小向上

31、逐渐减小 3凝胶过滤层析凝胶过滤层析 (分子排阻分子排阻 )n（1）凝胶过滤的介质）凝胶过滤的介质 n凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构， 经常使用的凝胶种类经常使用的凝胶种类：n（1）葡聚糖凝胶，）葡聚糖凝胶，是由线形的是由线形的1，6葡聚糖与葡聚糖与1氯氯2，3葡聚糖葡聚糖环环氧丙烷反应而成的化合物，它的商品名氧丙烷反应而成的化合物，它的商品名称为称为Sephadex。不同型号的。不同型号的Sephadex 用用G来表示。来表示。G后面的数字后面的数字-10、200表示表示吸水量为吸水量为1、20克克/克干胶。如克干胶。如Sephadex G-100 交联葡聚糖凝胶的种类

32、有交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和，和G-200。因此，。因此，“G”反反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。交联度越高，凝胶孔径越部范围。交联度越高，凝胶孔径越小。小。 G10G10、1515、2525 分离范围分离范围5000 5000 适用于适用于脱盐、肽与其它小分子的分离，胶柱脱盐、肽与其它小分子的分离，胶柱长要求长要求15-2515-25厘米。厘米。 G-50 G-50 分离范围分离范围 1500-30000 1500-30000 G-75 G-75 分离范围分离范围 3000-8000

33、0 3000-80000 G-100 G-100 分离范围分离范围 4000-1500004000-150000 G-200 G-200 分离范围分离范围 5000-6000005000-600000适用于各类生物分子的分离，胶柱长要适用于各类生物分子的分离，胶柱长要求求8080厘米以上。厘米以上。 n（2）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 (商品名称商品名称为为Bio-gel P)是一种人工合成的凝胶，它是一种人工合成的凝胶，它是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双和交联剂甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺(Bis)共聚而成的。不同型号的共聚而成的。不同型号的Bio-gel 用用P来表示

34、。来表示。 P后面的数字再乘后面的数字再乘以以1000为该型号的排阻极限，表示当某为该型号的排阻极限，表示当某一物质的分子量大于或等于某一值时，一物质的分子量大于或等于某一值时，完全不进入凝胶。完全不进入凝胶。如如Bio-gel P-60 （3）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶 商品名称为商品名称为Sepharose或或Bio-Gel A，琼脂糖是从，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。不同型号的是孔径大，排阻极限高。不同型号的Sepharose 用用B来表示。来表示。 B前面的数前面的数字表示凝胶中含干胶的量，如字表示凝胶中含干胶的量，如 S

35、epharose 6B二、利用溶解度差别的纯化方法二、利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度有：影响蛋白质溶解度有：n自身因素：自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。的偶极矩等。n外部因素：外部因素：很多，其中主要有：很多，其中

36、主要有：溶液的溶液的pH，离子强度，离子强度，介电常数，介电常数，温度温度。1. pH控制蛋白质的沉淀控制蛋白质的沉淀n蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。而趋于聚集沉淀。n不同的蛋白质具有不同的等电点，利用不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。可以把蛋白质混合物分开。 2. 蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这

37、种现象称为盐溶白质的溶解度，这种现象称为盐溶。由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高因而溶解度增高盐溶盐溶 盐析：盐析：当溶液的离子强度增加到一定数当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（沉淀出来，这

38、种现象称为盐析（salting out）。）。大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致蛋白质表面的疏水基团的暴露蛋白质表面的疏水基团的暴露盐析盐析（NH4）2SO4 、 Na2SO4 ）3有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙如甲醇、乙醇和丙酮等酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随

39、着变性。起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。有机溶剂分级分离的有机溶剂分级分离的机理机理n有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了改变了介质的介电常数介质的介电常数。水是高介电常数物质。水是高介电常数物质(20时，时，80)，有机溶剂是低介电常数物质，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇时，甲醇33，乙醇乙醇24，丙酮，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进

40、了蛋白质分子的聚集和沉淀。了蛋白质分子的聚集和沉淀。n有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与与盐盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。集而沉淀。 4温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 n在一定温度范围内，约在一定温度范围内，约040之间，大之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，增加， n在在4050以上，大部分蛋白质变得不以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性稳定并开始变性，一般在中性pH介质中介质中即失去溶解能力。即失

41、去溶解能力。n大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在蛋白质的分级分离操作一般都在0或更或更低的温度下进行。低的温度下进行。 三、根据电荷不同的纯化方法三、根据电荷不同的纯化方法 n根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有质混合物的方法有电泳电泳和和离子交换层析离子交换层析两类两类 n一一. 电泳电泳(electrophoresis)n在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。反的电极移动，这种现象称为电泳

42、。 n蛋白质蛋白质电泳电泳分离原理分离原理：分子大小不同的蛋白质所分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。因此，在电泳时可以分开。1、电泳的类型、电泳的类型 目前电泳的目前电泳的类型很多，类型很多， 最常见的是最常见的是区带电泳区带电泳，由于在支持由于在支持物上电泳时物上电泳时蛋白质混合蛋白质混合物被分离成物被分离成若干区带而若干区带而得名。得名。n区带电泳按其支持物的物理性状不同可区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成以分成4类：类：n 滤纸电泳和薄膜电泳滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜如醋酸纤维薄

43、膜电泳和聚酰胺薄膜电泳电泳和聚酰胺薄膜电泳)；n 粉末电泳，粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；铺设成平板；n 细丝电泳，细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；泳，这是一类微量电泳；n 凝胶电泳，凝胶电泳，最常用的支持介质有最常用的支持介质有聚丙聚丙烯酰胺烯酰胺和和琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，这两种凝胶电泳的分辨率都很高， -+ 2、

44、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylaminde gel electrophoresis，简称，简称PAGE)n也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般一般制作成凝制作成凝胶柱或凝胶板，胶柱或凝胶板，垂直板电泳的优越性：垂直板电泳的优越性： 表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应， 条带更清晰；条带更清晰； 在同一块胶板上，可同时进行在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的个以上样品的 电泳，便于在同一条件下比较分析鉴

45、定，还可电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可 用于印迹转移电泳及放射自显影；用于印迹转移电泳及放射自显影； 胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率 高，不仅可用于分析，可用于制备；高，不仅可用于分析，可用于制备； 胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于 长期保存与扫描；长期保存与扫描； 可进行双向电泳。可进行双向电泳。按其凝胶的组成系统可分成四种：按其凝胶的组成系统可分成四种：(1) 连续凝胶电泳：连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的只用一层凝胶，采用相同的pH值和相同的缓冲液。值和相同的缓冲液。(2)

46、不连续凝胶电泳：不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的采用二层或三层性质不同的凝胶凝胶(即：样品胶、浓缩胶和分离胶即：样品胶、浓缩胶和分离胶)重叠起来，重叠起来，使用两种不同的使用两种不同的pH值（值（6.7和和8.3）和不同的缓冲）和不同的缓冲液（液（Tris-HCl和和Tris-Gly）(3) 孔梯度凝胶电泳孔梯度凝胶电泳：采用梯度混合装置，使制得：采用梯度混合装置，使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小的凝胶由上至下孔径逐渐减小(即凝胶浓度由上即凝胶浓度由上至下逐渐增高至下逐渐增高)。梯度凝胶电泳主要适宜于测定。梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。球蛋白的相对分子质量。(4) S

47、DS凝胶电泳：凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中在聚丙烯酰胺凝胶中加入加入 SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) (5) 等电聚焦等电聚焦凝胶电泳：凝胶电泳：(IEF-PAGE) 在电泳支持介质中加入在电泳支持介质中加入载体两性电解质载体两性电解质(carrier ampholytes)，通以直流电后在正负极之间形成，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在梯度，蛋白质在pH梯梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。决定于其本身的等电点。3、凝胶聚合的原理及有关特性、凝胶聚合的原理及有关特性1

48、聚合反应聚合反应 凝胶的聚合凝胶的聚合单体单体:丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉和交联剂甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺(Bis)；常用过硫酸铵常用过硫酸铵(AP)为催化剂，为催化剂，四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。为加速剂。TEMED的碱的碱基可催化基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活水溶液产生游离氧原子，激活Acr单单体，使其聚合成单体长链，在体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成作用下，聚合成网状凝胶网状凝胶（化学聚合）（化学聚合）。碱性条件下凝胶易聚合。碱性条件下凝胶易聚合，室温下，室温下7.5的凝胶在的凝胶在pH8.8时时30min聚合，在聚合，在pH4.3时

49、约需时约需90min。 此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照（光（光聚合）聚合） ，故使用不多。，故使用不多。 凝胶的孔径随着凝胶的孔径随着Acr 的浓度的变化而变的浓度的变化而变化，也跟化，也跟Bis的浓度有关的浓度有关T T = (a+b)/m = (a+b)/m l00 l00c c = b/(a+b) = b/(a+b) 100 100式中式中 a a：AcrAcr克数；克数； b b：BisBis克数；克数； m m：缓冲液体积：缓冲液体积(ml)(ml)。 T T：AcrAcr和和BisBis总浓度总浓度 c c：交联剂百分比：交联剂百分比再按要

50、求配制不同浓度的凝胶。再按要求配制不同浓度的凝胶。注意点：注意点：1 1、 Acr- Bis Acr- Bis贮液在自然光、贮液在自然光、射线、超声波的引射线、超声波的引发下会发生聚合，故应放在发下会发生聚合，故应放在棕色瓶中避光保存棕色瓶中避光保存。 30%30%的贮液的贮液44下只能保存一个月。下只能保存一个月。2 2、 AcrAcr、 BisBis均为均为神经毒性神经毒性，勿触及皮肤和粘膜。，勿触及皮肤和粘膜。3 3、过硫酸铵应现配现用。、过硫酸铵应现配现用。定溶至定溶至100100毫升得毫升得 T=30% C=2.6%T=30% C=2.6%的的贮液贮液Acr 29.2克克Bis 0.

51、8克克凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系T 凝胶的孔径与样品的凝胶的孔径与样品的迁移率迁移率有关有关ABT%迁移率迁移率分子量：分子量：A AB B 电荷：电荷：A AB B迁移率随着凝胶浓度的变化迁移率随着凝胶浓度的变化 而变化而变化单一条带不能说明是一种组分单一条带不能说明是一种组分 连续系统：连续系统： 电泳体系中缓冲液、电泳体系中缓冲液、pH值及凝胶浓度相值及凝胶浓度相同，即只有同，即只有分离胶。分离胶。带电颗粒在电场作带电颗粒在电场作用下，主要靠用下，主要靠电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应，无浓缩效应。无浓缩效应。 4、连续凝胶系统和不连

52、续凝胶系统连续凝胶系统和不连续凝胶系统 不连续系统不连续系统： 一般常用二层或三层。由上而下分为：一般常用二层或三层。由上而下分为： 1、样品胶样品胶 2、浓缩胶浓缩胶 3、分离胶分离胶 电泳体系中各层胶中缓冲液离子成分、电泳体系中各层胶中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度都不同。、凝胶浓度及电位梯度都不同。 样品胶：样品胶： T=3，c=2.6，缓冲液为，缓冲液为pH6.8的的Tris-HCl，其作用是防止对流，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前，前，一般不用样品胶，一般不用样品胶，直接将样品加入蔗直接将样品加入蔗糖或甘油后加在

53、浓缩胶的表面糖或甘油后加在浓缩胶的表面，同样具有，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。防止对流及样品被稀释的作用。 浓缩胶：浓缩胶： T=5，c=2.6的大孔胶，的大孔胶，缓冲缓冲液为液为pH6.8的的Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷)，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。的区带，从而提高分离效果。 浓缩效浓缩效应应 分离胶分离胶：T=7.0一一20%，c=2.5的小孔的小孔胶，胶，缓冲液为缓冲液为pH8.9的的Tris-HCl，大部分蛋，大部分蛋白质在此白质在此pH条件下带负电荷，样品在该层条件下带负电荷，

54、样品在该层被分离。被分离。电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应，不连续不连续PAGE电泳的电泳的3种物理效应种物理效应： 样品的样品的浓浓缩缩效应；效应； 凝胶对被分离分子的凝胶对被分离分子的筛选筛选效应效应(颗粒小颗粒小的移动快，颗粒大的移动慢的移动快，颗粒大的移动慢)； 一般电泳分离的一般电泳分离的电荷电荷效应。效应。由于这由于这3种物理效应，使样品分离效果好，种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。人血清用纸电泳只能分成分辨率高。人血清用纸电泳只能分成57个组分，而圆盘电泳则可分成几十个清个组分，而圆盘电泳则可分成几十个清晰的条带。晰的条带。 样品浓缩效应样品浓缩效应(由三种不连续性

55、造成由三种不连续性造成) （1）凝胶孔径的不连续性）凝胶孔径的不连续性 上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。很窄的区带。浓缩胶分离胶(2) 缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pH值的不连续性值的不连续性 HCl在任何在任何

56、pH溶液中均溶液中均易解离出易解离出Cl，在电场中，在电场中迁移率快，走在最前面迁移率快，走在最前面称为称为快离子快离子。 在电极缓冲液中，除有在电极缓冲液中，除有Tris外，还有外，还有甘氨酸甘氨酸，其，其pI=6.0，在，在pH8.9的电极的电极缓冲液中，易解离出甘缓冲液中，易解离出甘氨酸根氨酸根(NH2CH2COO)，而在而在pH6.7的凝胶缓冲体的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅系中，甘氨酸解离度仅有有0.11，因而在电，因而在电场中迁移很慢，称为场中迁移很慢，称为慢慢离子离子。Tris-HClpH=6.7pH=8.9GlyCl-Gly-Tris-HCl带负电的蛋白质带负电的蛋白质, ,

57、迁移率介于快迁移率介于快离子与慢离子之间离子与慢离子之间+电泳缓冲体系，Tris-Gly,pH=8.3(3) 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 电泳开始后，快离子的快速移电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。带。分子筛效应分子筛效应 大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是这就是分子筛效应分子筛效应。 蛋

58、白质进入蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。白质分成各自的区带。 这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。小分子后流出。电荷效应电荷效应 在在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷

59、不同的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带。形状，以一定顺序排成一个个区带。4、SDS凝胶电泳：凝胶电泳：5、等电聚焦、等电聚焦 (isoelectric focusing，IEF) 等电聚焦是等电聚焦是60年代建立的一种高分辨率的蛋白质年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其他两分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其他两性电解质分子具有不同的等

60、电点，从而在一个稳性电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、线性的定、连续、线性的pH梯度中得到分离。梯度中得到分离。 近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提高，可以分辨高，可以分辨pI只差只差0.01的生物大分子，这是等电的生物大分子，这是等电聚焦最突出的优点，聚焦最突出的优点，蛋白质等电聚焦电泳的基本原理蛋白质等电聚焦电泳的基本原理 在电泳支持介质中加入在电泳支持介质中加入载体两性电解质载体两性电解质(carrier ampholytes)，通以直流电后在正负极之间形成稳，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的定、连续和线性的