高效液相色谱分析技术-原理(陈桂良)

1、高效液相色谱分析技术 上海市食品药品检验所 色谱技术丛书傅若农主编 化学工业出版社. 北京.2000 高效液相色谱分析技术 1. 1. 简介简介 2. 2. 基本概念、定义和色谱理论基本概念、定义和色谱理论 3. 3. 色谱柱和色谱模式色谱柱和色谱模式 4. 4. 仪器仪器 5. 5. 方法开发方法开发 6. 6. 方法验证方法验证 7. 7. 注意事项注意事项 每时每刻的挑战：混合物的分离分析每时每刻的挑战：混合物的分离分析 提取提取 蒸馏蒸馏 离心离心 过滤过滤 常用的分离方式常用的分离方式 色谱色谱 1906年，年，Tswett 发现色谱分离现象发现色谱分离现象 碳酸钙碳酸钙 石油醚石油

2、醚 石油醚石油醚 色带色带 A 样品样品 固定相固定相 检测器检测器 B tA tB 洗脱液洗脱液 色谱法的分类色谱法的分类 色谱法色谱法 液相色谱法液相色谱法（LC） 气相色谱法气相色谱法（GC） 超临界流体色谱法超临界流体色谱法（SFC） 高效液相色谱法高效液相色谱法 （HPLC） 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法（HPCE） 平板色谱法平板色谱法 柱色谱法柱色谱法 液液 相相 色色 谱谱 法法 经典液相色谱法经典液相色谱法 纸色谱法纸色谱法 薄层色谱法薄层色谱法（TLC） 色谱学发展历史色谱学发展历史 1906年，年，Tweet发现色谱分离现象。发现色谱分离现象。 1941年，年，Mar

3、tin和和Synge发明了利用物质发明了利用物质 在两种不相混溶的溶剂中因分配系数的不在两种不相混溶的溶剂中因分配系数的不 同而达到分离的同而达到分离的“分配色谱法分配色谱法”，1952年年 获获Nobel奖。同时提出以气体为流动相。奖。同时提出以气体为流动相。 1938年，苏联人发明了薄层色谱法，薄层年，苏联人发明了薄层色谱法，薄层 色谱法首次用作酊剂中成分的分离。色谱法首次用作酊剂中成分的分离。 1944年，年，Consden、Gordon与与Martin发明发明 了纸色谱法，以纸代替吸附剂的了纸色谱法，以纸代替吸附剂的“纸色谱纸色谱 法法”。 1956年，年，Stahl系统研究了硅胶的规

4、格、性系统研究了硅胶的规格、性 能及薄层厚度对薄层色谱的影响后，薄层能及薄层厚度对薄层色谱的影响后，薄层 法在各个方面才逐渐得到发展。法在各个方面才逐渐得到发展。 1952年，年，James和和Martin，气相色谱法，气相色谱法 发明了以气体为流动相的发明了以气体为流动相的“气相色谱法气相色谱法”。 1957年，年，Golay，开口毛细管（，开口毛细管（open- tubular column）一次可分离几百个样品。）一次可分离几百个样品。 1959年，年，Perflodin，空间排阻色谱法，空间排阻色谱法 分离生物大分子。分离生物大分子。 1964年，年，Giddings（American

5、） 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） 条件：（条件：（1）高压泵的出现）高压泵的出现 （2）高灵敏度的检测器）高灵敏度的检测器 70年代商品化，年代商品化，8090年代发展年代发展 21世纪，联用技术世纪，联用技术 UPLC 等等 HPLC与GC 基本概念及理论基础（如保留值、塔板理论、速率理论、 容量因子、分离度等是一致的 进样方式的不同；流动相的不同；由于液体的粘度较气 体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系 数比在气体流动相中约小45个数量级；由于流动相的化 学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系， 满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨 率（柱效能

6、）；高效液相色谱采用510Lm细颗粒固定相， 使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大， 必须借助高压泵输送流动相；高效液相色谱是在液相中 进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的分光光度检 测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光 光度检测器等；高效液相色谱同样具有高灵敏度、高效 能和高速度的特点。 2005年版中国药典二部 有223个品种采用HPLC方法取代传统的容量法 或紫外法或生物检定法。例如盐酸小檗碱片与 胶囊含量测定原采用滴定法，多种生物碱均可 参与滴定反应，本版药典修订为HPLC法，可准 确测定小檗碱的含量；醋酸泼尼松片含量测定 原采用紫外法，难以区分结构类似的物质，

7、修 订为HPLC方法大大提高了方法的专属性。氯霉 素、罗红霉素、克拉霉素与庆大霉素等多种抗 生素原含量测定方法采用微生物检定法，本版 药典（二部）改用HPLC法，3种氨基糖苷类采 用蒸发光散射检测器。 正文中近30种复方制剂，其中18种已采用HPLC 方法。HPLC方法不仅提高了方法的专属性，并 且简化了实验过程。例如复方磺胺甲噁唑制剂 由磺胺甲噁唑与甲氧苄啶组成，原采用计算分 光光度法，现修订为HPLC法；双唑泰栓由甲硝 唑、克霉唑与醋酸氯己定组成的复方制剂，原 含量测定方法为滴定法、UV法与滴定法和UV组 合三个方法分别测定，方法繁琐且干扰因素多， 现修订为HPLC方法，在一个色谱条件下能

8、有效 分离三个组分；异福酰胺片（胶囊），采用等 度HPLC方法能有效分离三种组分及降解产物醌 式利福平，保证方法的准确性。 2005年版中国药典一部中采用HPLC作为 含量测定方法的有479个品种，涉及518 项；二部中采用HPLC作为含量测定方法 的有848个品种。 药物分析杂志 HPLC论文数：85% 基本概念、定义和色谱理论 当流动相中所有组分维持不变时达到分 离，这个过程称为等度洗脱（isocratic elution）。如果流动相中一种或多种溶剂 的组成随时间连续变化时，称为梯度洗 脱（gradient elution） 两个相邻洗脱峰的分离程度和质量可以 用保留因子（k，或容量因子

9、）、选择 因子（）和理论板数（N）来表达 容量因子 ：0.4k2030 k 25为佳，过大则耗时太长 0 0 t tt k R 溶质在流动相中的量 溶质在固定相中的量 k 选择因子（）1.1为好 )1( )2( )1( )2( k k t t R R Rt = 3.0 min. faster moving less retained Rt = 5.2 min. slower moving more retained 0 1 2 3 4 5 6 7 Time (minutes) Absorbance Approximation of peak area by triangulation Area

10、 = base x height 2 base height Peak APeak B HPLC色谱图 分离度 两个相邻流出峰间的分离程度用分离度R 来评价。其中W1和W2为峰宽，t1和t2为 保留时间，单位相同。 R值越大，分离越好。R值为1.00时，如 果每个峰都符合高斯分布，被测物纯度 大约为97.7。事实上，峰纯度要达到 99.8以上，分离度至少应为1.5。 )/()(2 2112 wwttR 分离效率 分离效率用理论板数N来描述 tr为保留时间，wB为基线处峰宽，w1/2为 半峰高处峰宽。 柱效与色谱柱填充颗粒的大小成反比。 因此分离效率按以下顺序排列： E为柱效，下标为颗粒大小 2

11、 2/1 2 )/(54. 5)/(16wtwtN rBr 1053 EEE 线速度：溶剂在柱中移动的速度线速度：溶剂在柱中移动的速度 mm/sec L柱长 t0 死时间 H(m) 柱内径 流量 线速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 L/min 1 mm/sec 由1 mm/sec 最佳线速度可计算出适合各种柱径的 最佳流量。 0 t L u 气相层析速率理论 Van Deemter方程式 式中 H理论塔板高度 u载气线速度 A多径项或涡流扩散项，表示由于柱的填充不均匀而引起峰的展 宽 B/u纵向扩散项或分子

12、扩散项，表示由于样品前后存在浓度梯度而 使运动着的分子产生纵向扩散 Cu传质阻力项，表示样品在流动相和固定相中移动受到阻力，造 成峰的扩张 Van Deemter方程式可说明填充均匀程度、载体粒度、载气种类、载气 流速、柱温、固定相液膜厚度等因素对柱效、峰扩张的影响。 CuuBAH/ 液相层析速率理论 Giddings方程式 式中 H理论塔板高度 u流动相线速度 A涡流扩散项 B/u纵向扩散项 Cmu、Csmu、Csu传质阻力项，分为三项 Csu固定相传质阻力项，主要是液液分配层析中组分在固定液中的传质 阻力 Cmu流动的流动相中的传质阻力项，流动相流经固定相时，靠近固定 相的流动相的流速较慢

13、，引起峰的增宽 Csmu滞留的流动相中的传质阻力项，由于固定相是多孔的，某部分流 动相会滞留在固定相的局部位置，影响传质速度 uCuCuCuBAH ssmm / 其他 理论板数、相邻峰的分离度、多次进样 的相对标准偏差百分数以及拖尾因子 （色谱峰形偏离对称高斯峰的程度）作 为系统适用性参数。 系统适应性试验 N=5.54*(tR/W1/2)2 =5.54*(1.065*60*tR/A/H)2 R=2(t2-t1)/(W1+W2) (1.5) T=T/2d (Ch.P 0.951.05; USP 2.5) RSD15,000psi) ） 快速进样器 快速检测器 系统体积的优化等 小颗粒填料 罗红霉素HPLC色谱图 范德米特(van Deemeter)曲线 UPLCTM与HPLC：速度比较