桑白皮黄酮平喘作用实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减桑白皮黄酮平喘作用实验研究(作者：单位：邮编：)作者：韦媛媛，徐峰，陈晓伟，陈侠，张国刚【摘要】目的研究桑白皮黄酮平喘作用。方法采用小鼠离体肺支气管灌流法，考察药物离体条件下拮抗乙酰胆碱的作用；采用豚鼠组胺 和乙酰胆碱雾化引喘模型、豚鼠卵蛋白引喘模型，以引喘潜伏期、血 浆血栓素B2(TXB2和6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1 a)含量 为评价指标，并对哮喘豚鼠肺组织进行病理检查，研究桑白皮黄酮的平喘作用。结果桑白皮黄酮拮抗乙酰胆碱对小鼠肺支气管的收缩作 用，延长组胺、乙酰胆碱引喘潜伏期和豚鼠卵蛋白性哮喘潜伏期，降 低哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞(EOS

2、)的浸润，但对哮喘豚鼠血浆中TXB2和 6-keto-PGF1 a水平的影响未统计出显著性。结论桑白皮黄酮具有一 定平喘作用。【关键词】桑白皮；黄酮；平喘Abstract : ObjectiveTo study the antiasthmatic effects ofandthe flavo noid of Cortex Mori (FCM).MethodsThe effect of FCM againstacetylcholine was examined with bronchotrachealperfusi on in mice in vitro.Histami ne-acetylcho

3、li neovalbumin were used to induce the asthma model in guinea pigs, respectively, and some other in dices were inv estigated including the latency of asthma, the content of TXB2and 6-keto -PGF1 a in the blood plasma.The lungs of guinea pigs were harvested, hematoxylin and eosin (HE)-stained, and the

4、 infiltrationof eosinophiles (EOS) was examined undermicroscope.ResultsThe con tractive effect of acetylcholi ne on bronchus was inhibited by FCM in vitro. The latency of asthma in duced by histami ne-acetylcholi ne and ovalbu min in mice was significantly prolonged by FCM. The number of EOS in lung

5、 of asthmatic guinea pigs was decreased by FCM. However, the content of TXB2 and 6-keto-PGF1 a in the blood plasma had no significantchange in asthmatic guinea-pigs.ConclusionFCM hasan tiasthmatic effect.Key words : Cortex Mori; Flavonoid; Antiasthmatic effect桑白皮(Cortex Mori)为桑科落叶灌木或小乔木植物Morusalba L

6、.除去粗皮的干燥根皮，具有泻肺平喘、利尿消肿等功效。有 报道桑白皮平喘作用与其中含有的香豆素类化合物(东莨菪内酯)1 和丙酮提取物2有关。桑白皮中黄酮化合物含量较大，且近年来 分离得到了多种化学成分3,但桑白皮黄酮的平喘作用研究较少。 鉴于黄酮类物质具有多种生理活性，本实验对分离提纯得到的桑白皮总黄酮的平喘作用进行探索。1材料与仪器1.1受试物及试剂桑白皮总黄酮（FCM :含桑色醇（含量为20 %）、桑根酮、桑皮素等黄酮类化合物的提取物，棕色干燥粉末， 由沈阳药科大学天然药物化学教研室提取4;磷酸组胺（His）:上 海丽珠东风生物技术有限公司；氯化乙酰胆碱 （Ach）:上海三爱思试 剂有限公司

7、；蛋白片：天津市东方卫生材料厂；TXB2和6-keto-PGF1a放射免疫试剂盒，南京建成生物研究所；其余试剂为分析纯。1.2动物豚鼠，动物使用许可证 SYXK辽）:2003 0012号；昆 明种小鼠67周龄，动物合格证为SCYK辽）:2003 0008号。均为 沈阳药科大学动物室提供。1.3仪器亚都医用雾化治疗器Yc-Y800,亚都科学技术股份有限 公司；FMJ全自动放射免疫r-计数器，上海市检测技术所上立检测仪 器厂。2方法与结果2.1统计计量资料的组间比较用t检验统计，计数资料显著性用 Fisher确切概率法统计。2.2小鼠肺支气管灌流实验小鼠，2530 g雌雄不限，颈椎脱 臼处死后，取

8、出气管与肺，置于盛有（37 士 1） C的含氧邵氏液的培养 皿内，剥离多余组织，将气管套在恒压灌流装置的套管上，参照文献 方法5进行恒压灌流。待流量恒定后，加入10-4 g/ml Ach 0.1 ml使气道收缩，固定流量通过气道的时间延长，记录10 ml灌流液流出时间（to ）。待恢复流量恒定后，加入不同浓度的受试药物0.1 ml （空 白对照加入等体积邵氏液），然后立即加入上述浓度 Ach 0.1 ml，同 法记录10 ml灌流液流出的时间（t1 ），并计算药物拮抗率 （） =t0-t1t0 X 100%结果见表1。FCM具有明显对抗乙酰胆碱收缩而缩 短肺支气管灌流固定流出量的时间。表1桑白

9、皮黄酮对小鼠肺支气管灌流的影响（略）2.3对豚鼠His和Ach引喘的影响豚鼠（体质量200 g），逐个放 入喷雾箱内，用超声雾化仪喷入 2.0% Ach和0.1% His混合液10 s， 挑选引喘潜伏期（从喷雾到哮喘发作，呼吸极度困难，直至抽搐跌倒 的时间）在150 s内的合格豚鼠，大于150 s的不选用。次日挑选合 格的豚鼠60只，雌雄各半，随机分成6组，10只/组，实验组分别 i.g FCM37.5 ,75,150,300 mg/kg，阳性对照组 i.g.氨茶碱 100 mg/kg 组，空白对照组给予等体积的蒸馏水。上述各组连续给药4 d，于末次给药后40 min将豚鼠逐个放入玻璃钟罩内，

10、同筛选条件进行喷雾， 记录豚鼠的引喘潜伏期和抽搐动物数，大于360 s不跌倒者按360 s计算。吸入的His、Ach作用于豚鼠气道上的H1、M受体造成支气管 收缩，使动物呼吸困难，此模型可以模拟哮喘呼吸道阻塞症状。结果 见表2。FCM低剂量组未统计出显著性差异，而其它FCM给药各组引喘潜伏期显著延长，最大可延长51.3 %，但抽搐的动物数并无统计学差异（P 0.05 ）。同时哮喘潜伏期实验结果提示，150 mg/kg的剂 量反应的药效已经接近最大值，再增加剂量药效不会相应增大。表2桑白皮黄酮对His、Ach所致哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响（略）2.4豚鼠卵蛋白哮喘实验豚鼠30只，随机分成6组，5

11、只/组，分别为对照组，模型组,FCM低、中、高剂量组，地塞米松组。 给药各组每只动物于两后腿i.m. 5 % 蛋白片生理盐水0.3 ml，并 同时i.p. 5 % 蛋白片生理盐水2 ml致敏，对照组给同体积生理盐 水。致敏10 d后给药，对照组、模型组ig给等体积的蒸馏水，FCM 组分别 i.g. 37.5，75，150 mg/kg，地塞米松组 i.m.10 mg/kg。致敏14 d后对照组雾化吸入生理盐水，其他组用1 %蛋白超声雾化吸入诱发哮喘。记录豚鼠10 min内出现H级哮喘（呼吸困难和咳嗽反 应）的潜伏期作为统计指标。之后，隔日喷雾反复诱发哮喘，并继续 给药。5 d后乌拉坦麻醉，取5

12、ml注射器吸取消炎痛-EDTA-Na2液约 0.1 ml，快速心脏穿刺取血5 ml，混匀，注入试管中，4C 3 500 r/min 离心15 min，分离血浆，-20 C保存，按放免试剂盒方法测定 TXB2 6-keto-PGF1 a。再将豚鼠处死，取右肺叶组织10%福尔马林中固定， 常规石蜡包埋，供病理组织切片，HE染色后光镜下进行组织学观察。豚鼠致敏后以卵蛋白雾化吸入，可诱发急性气道过敏反应， 包括速发相哮喘反应和迟发相哮喘反应，这种模型较类似于人类哮 喘。由于I级哮喘反应（仅呼吸困难）不易于观察，而发生皿级反应 （呼吸困难、咳嗽、休克跌倒）会造成豚鼠死亡率较大，故记录豚鼠 发生H级哮喘反

13、应的潜伏期作为评价指标。 模型组豚鼠约在吸入卵蛋 白后2 min发生哮喘反应，低剂量FCM与模型组相比没有显著差异， FCM 150 mg/kg能显著延长H级哮喘潜伏期。结果见表 3。反复喷雾卵蛋白诱发哮喘后，产生哮喘迟发相反应，模型组 豚鼠血浆中6-keto-PGF1 a含量较对照组明显减少（P0.01），TXB2含 量较对照组明显增高（P0.05），但给药各组未统计出显著性差异（P0.05）。哮喘的迟发反应会引起嗜酸性粒细胞 （EOS）在肺部的聚集 和浸润。我们在正常豚鼠肺组织中并未发现EOS而模型组豚鼠肺组织有大量EOS聚集，经FCM台疗后，75 mg/kg剂量组EOS明显减少， 150

14、 mg/kg剂量组偶见少许EOS结果见图15,结果提示，FCM有 可能是减少了聚集到气道的EOS发挥抗炎作用并缓解哮喘症状。表3 桑白皮黄酮对卵蛋白所致哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响（略）3讨论哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细 胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组份参与的气道慢性炎症 性疾患6，在我国其发病率呈逐年上升趋势。近年分离得到一些桑 白皮黄酮类物质，具有多种生理活性如：抗病毒7、降压8、抗 HIV等作用，经过实验论证，很有可能在黄酮中也存在具有平喘作用 的物质。嗜酸性粒细胞浸润程度与哮喘患者气道炎症密切相关9。本实验中卵蛋白致敏攻击后，隔日喷雾卵蛋白反复诱发哮喘的发

15、生，模拟哮喘患者反复接触变应原使病情逐渐恶化的过程，6日后在肺部 组织切片中均发现有大量的嗜酸性粒细胞， 而对照组豚鼠肺组织无炎 性细胞浸润，FCM台疗组减少嗜酸性粒细胞在肺部的浸润程度，提示 药物治疗过程中减少了聚集到气道的 EOS这就相当于降低了 EOS处 理和递呈特异性抗原的能力，从而减轻了 EOS所释放的毒性蛋白对肺 组织的损伤以及气道高反应性的形成，因而可能是抗气道炎症的作用 发挥平喘作用。哮喘时，花生四烯酸生成 TXB2/PGI2失衡，引起血管渗出、 气管粘膜水肿及平滑肌痉挛10。6-keto-PGF1 a为PGI2在体内的 代谢产物，通过测定血浆中TXB2 6-keto-PGF1

16、 a的浓度变化，可以 研究多种因素对哮喘的影响。但实验未统计出显著性差异，有可能药 物不是通过这条途径改善哮喘症状的。【参考文献】:1徐宝林,张文娟，孙静芸.桑白皮提取物平喘、利尿作用的研究J.中成药,2003,25(9):758.:2冯冰虹，苏浩冲，杨俊杰.桑白皮丙酮提取物对呼吸系统的药理作用J.广东药学院学报，2005,21(1):47.3张国刚，黎琼红，叶英子博，等.桑白皮黄酮化学成分的研究J.中国药物化学杂志,2005,15(2):108.:4张国刚，黎琼红，李乐道，等.桑白皮中总黄酮提取工 艺研究J.中草药,2005,36(11):1662.:5徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第1版M . 北京:人民卫生出版社,2002 : 1181.6中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治 指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案)J.中华 结核和呼吸杂志，2003,26(3):132.:7张国刚，左甜甜，张 岩,等.桑白皮中抗病毒活性成分桑 酮G的含量测定J.中南药学,2008,6(2):144.:8李洪玉，孙静芸，吴素香.不同来源桑白皮降压成分 桑根酮G含量测定J.中成药,2002,24(2):104.9 Trautma