PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应

1、课题课题2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应课标领航课标领航1尝试尝试PCR(DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应)技术的技术的基本操作。基本操作。2理解理解PCR的原理和反应过程。的原理和反应过程。3讨论讨论PCR的应用。的应用。【重点】【重点】PCR的原理和反应过程。的原理和反应过程。【难点】【难点】PCR技术的操作过程。技术的操作过程。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应情境导引情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采链式反应技术，它采用分子技术用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判模拟核酸在体内的复制，从

2、而判,定定疾病病原体的种类，所以从本疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是质上来说，这是一种分子诊断方法。一种分子诊断方法。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应核心要点突破核心要点突破知能过关演练知能过关演练课课题题2多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段基础自主梳理基础自主梳理PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应基础自主梳理基础自主梳理一、一、PCR扩增的原理及条件扩增的原理及条件1概念：概念：PCR即即_，是一种体外，是一种体外迅速扩增迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的为模板，在短时间内复制出上百万份的DN

3、A拷贝。拷贝。2原理原理(1)DNA的热变性：在的热变性：在80100 的温度范围内，的温度范围内，DNA_结构解体，双链分开，这个过程称结构解体，双链分开，这个过程称为为_。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。链又会重新结合成双链。多聚酶链式反应多聚酶链式反应DNA双螺旋双螺旋变性变性PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应(2)子链的合成：子链的合成：需要需要_；合成方向总是从合成方向总是从子链的子链的5端向端向3端延伸。端延伸。3条件条件(1)_模板。模板。(2)分别与模板分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。两条链相结合的两种引物

4、。(3)A、T、G、C四种四种_。(4)耐热的耐热的DNA聚合酶，一般用聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。聚合酶。(5)需要稳定的需要稳定的_和能严格控制和能严格控制_的温控设备的温控设备.引物引物DNA脱氧核苷酸脱氧核苷酸pH温度温度PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应思考感悟思考感悟 1什么是引物？若要克隆什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特，应加入几种特定的引物？定的引物？【提示】【提示】所谓引物是指两段与待扩增的所谓引物是指两段与待扩增的DNA序序列互补的一小段列互补的一小段DNA或或RNA片段。片段。DNA是由两条是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在反向平行排列的脱氧

5、核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只，只能从引物的能从引物的3端延伸端延伸DNA链，因此克隆链，因此克隆DNA时时应加入两种引物。应加入两种引物。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应二、二、PCR反应过程反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为为_、复性和延伸三步。、复性和延伸三步。1变性：当温度上升到变性：当温度上升到_以上时，双链以上时，双链DNA解聚为单链。解聚为单链。2复性：温度下降到复性：温度下降到_左右，两种引物通左右，两种引物通过过_与两条单链与两条单链DNA结合

6、。结合。3延伸：温度上升到延伸：温度上升到_左右，溶液中的四种左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的基互补配对原则合成新的DNA链。链。变性变性90 50 碱基互补配对碱基互补配对72 DNA聚合酶聚合酶PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应思考感悟思考感悟 2PCR循环过程中，变性温度设置循环过程中，变性温度设置95 ，时间，时间设置设置30 s的原因是什么？的原因是什么？【提示】【提示】变性温度过低，解链不完全导致变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度

7、条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应三、实验操作三、实验操作1实验用具实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控仪：该仪器能自动调控_，实现，实现DNA的的扩增。如果没有扩增。如果没有PCR仪，可用仪，可用3个个_代代替，操作时按程序在替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移个水浴锅中来回转移PCR反反应的微量离心管。应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行，实际上是进行离心的场所。离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体

8、，配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。换。温度温度恒温水浴锅恒温水浴锅PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应2操作步骤操作步骤准备准备_混合混合_反应。反应。 四、操作提示四、操作提示1为避免外源为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行的一些用具在使用前必须进行_。2所用的所用的_和酶应分装成小份，并在和酶应分装成小份，并在20 储存。储存。五、五、DNA含量的测定含量的测定1原理：利用原理：利用DNA在在260 nm的紫外线波段的的紫外线波段的_曲线来测定相应含量。曲线来测定相应

9、含量。2计算公式：计算公式：DNA含量含量(g)50(260 nm的读的读数数)_。移液移液离心离心高压灭菌高压灭菌缓冲液缓冲液吸收吸收稀释倍数稀释倍数PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应核心要点突破核心要点突破PCR原理原理1PCR扩增方向：为了明确地表示扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，的方向，通常将通常将DNA的羟基的羟基(OH)末端称为末端称为3端，而磷端，而磷酸基团的末端称为酸基团的末端称为5端。端。DNA聚合酶不能从头聚合酶不能从头开始合成开始合成DNA，而只能从，而只能从3端延伸端延伸DNA链，即链，即DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延端延伸。

10、伸。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应2PCR原理原理DNA的热变性原理的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。仪器。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应3生物体内生物体内DNA复制与复制与PCR反应的区别反应的区别体内复制体内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用下，细胞提供能在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开量，部分解开加热至加热至90 以上时，双链全部以上时，双链全部解开，不需解旋酶解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNA可以是可以是RN

11、A或单链或单链DNA分子分子片段片段合成子链合成子链在引物基础上，一条链连续合在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度都是连续合成，控制温度72 特点特点边解旋边复制，半保留复制边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增Taq DNA聚合酶聚合酶不需要不需要需要需要循环次数循环次数受生物体自身控制受生物体自身控制30多次多次相同点相同点生物体内的生物体内的DNA复制和复制和PCR体外体外DNA扩增都需要模板、四种扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行脱氧核苷酸，

12、且都需要在一定的缓冲溶液中进行PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应 (2011年聊城高二检测年聊城高二检测)下列关于下列关于DNA复制复制和和PCR的描述中，正确的是的描述中，正确的是()ADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从，只能从5端延伸端延伸DNA链链BDNA复制不需要引物复制不需要引物C引物与引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合母链通过碱基互补配对进行结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】【尝试解答】_C_PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应【解析】【解析】由于由于DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只

13、能从，只能从3端延伸端延伸DNA链，故链，故DNA复制需复制需要引物，而且它与要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结母链通过碱基互补配对结合。合。PCR扩增的对象是扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。，而不是氨基酸。【探规寻律】【探规寻律】(1)引物是一小段引物是一小段DNA或或RNA，它，它能与能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引母链的一段碱基序列互补配对。包括引物物和引物和引物两种。用于两种。用于PCR的引物长度通常为的引物长度通常为2030个核苷酸。个核苷酸。(2)细胞内细胞内DNA复制与复制与PCR技术的原理和过程容易技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分发生混淆，特

14、别应注意区分PCR反应需要可变的反应需要可变的温度，而体内温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。复制需要稳定的温度。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应跟踪训练跟踪训练(2011年海淀区高二检测年海淀区高二检测)关于关于DNA片片段段PCR扩增实验的描述中不正确的是扩增实验的描述中不正确的是()A加入的加入的Taq DNA聚合酶耐高温聚合酶耐高温B不同大小不同大小DNA在电场中迁移速率不同在电场中迁移速率不同C此过程需要此过程需要DNA连接酶连接酶D扩增区域由两种引物来决定扩增区域由两种引物来决定PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应解析：选解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，扩增实

15、验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的故需要耐高温的Taq DNA聚合酶，但不需要聚合酶，但不需要DNA连接酶，连接酶，A项正确，项正确，C项错误。因为不同大小的项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，率不同，B项正确。项正确。PCR扩增需要两种引物，分别扩增需要两种引物，分别与与DNA的两条模板链互补，则的两条模板链互补，则D项正确。项正确。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应PCR反应的实验操作过程反应的实验操作过程1反应体系的配方反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液倍浓缩的扩增缓冲液5 L20 mmol/L的的4种脱

16、氧核苷酸的等量混合种脱氧核苷酸的等量混合液液1 L20 mol/L的引物的引物2.5 L20 mol/L的引物的引物2.5 LH2O2833 L15 U/L 的的TaqDNA聚合酶聚合酶12U模板模板DNA510 L注：注：总体积总体积50 L，模板模板DNA的用量在的用量在1 pg1 mg之间之间PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应2.实验用具实验用具(1)PCR仪：仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计自动化程度较高，参照下表设计程序即可。程序即可。循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94 ，5 min30次次94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一次最后一次

17、94 ，1 min 55 ，30 s72 ，1 minPCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应若无若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水浴锅的温度分别为浴锅的温度分别为94 、55 和和72 ，然后按，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应反应的微量离心管。的微量离心管。(2)微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5 mL。(3)微量移液器：用于定量转移微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。其上的一次性吸液枪头用一次更换

18、一次。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应3实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分 盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 将微量离心管放在离心机上，离心约将微量离心管放在离心机上，离心约10 min 将离心管放入将离心管放入PCR仪上，设置好仪上，设置好PCR仪的循环程序仪的循环程序PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应 (2011年长春高二检测年长春高二检测)多聚酶链式反应多聚酶链式反应

19、(PCR技术技术)是在实验室中以少量样品是在实验室中以少量样品DNA制备大制备大量量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷种脱氧核苷酸等。反应中新合成的酸等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反又可以作为下一轮反应的模板，故应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过数以指数方式扩增，其简要过程如图所示。程如图所示。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应(1)某个某个DNA样品有样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基条单链上碱基AGTC1234，则经过，则经

20、过PCR仪五次循环后，将产生仪五次循环后，将产生_个个DNA分子，分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是_个。个。(2)分别以不同生物的分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是之间存在差异，这些差异是_。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应(3)由于由于DNA分子上的分子上的“遗传因子遗传因子”基本都是符合基本都是符合孟德尔的遗传规律的，因此人类可以利用孟德尔的遗传规律的，因此人类可以利用PCR技技术合成的术合成的DNA进行亲子鉴定，其原理是：首先获进行亲子鉴定，其原理是：首先获取被测试

21、者的取被测试者的DNA，并进行，并进行PCR扩增，取其中一扩增，取其中一样本样本DNA用限制性核酸内切酶切成特定的小片段，用限制性核酸内切酶切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使小片段分离，再使用特别的用特别的“探针探针”去寻找基因。相同的基因会凝去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起，然后利用特别的染料在聚在一起，然后利用特别的染料在X光下，便会光下，便会显示由显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。每个人探针凝聚于一起的黑色条码。每个人的条码一半与其母亲的条码吻合，另一半与其父的条码一半与其母亲的条码吻合，另一半与其父亲的条码吻合。亲的条码吻合。PC

22、R扩增DNA导致的多聚酶链式反应限制性核酸内切酶能将限制性核酸内切酶能将DNA样品切成特定的小样品切成特定的小片段，这主要体现了酶的片段，这主要体现了酶的_。A专一性专一性 B高效性高效性C多样性多样性 D作用条件温和作用条件温和2002年年6月，我国第一张月，我国第一张18位点的位点的“基因身份基因身份证明证明”在湖北武汉诞生。人的在湖北武汉诞生。人的“基因身份证明基因身份证明”是否终身有效？是否终身有效？_，理由是，理由是_。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应(4)请指出请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处：技术与转录过程的三个不同之处：_；_；_。PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反

23、应【尝试解答】【尝试解答】(1)326200(2)碱基碱基(脱氧核苷酸脱氧核苷酸)的数目、比例和排列顺序不同的数目、比例和排列顺序不同(3)A是因为同一个体的不同生长发育阶段和不同组是因为同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的织的DNA是相同的，所以它有高度的个体特异性和是相同的，所以它有高度的个体特异性和稳定性稳定性(4)PCR技术以技术以DNA的两条单链为模板合成子代的两条单链为模板合成子代DNA，转录以，转录以DNA的一条单链为模板合成的一条单链为模板合成RNAPCR技术的原料为脱氧核苷酸，转录的原料是核技术的原料为脱氧核苷酸，转录的原料是核糖核苷酸糖核苷酸二者反应时的催化酶不同二者反应时的催化酶不同(或其他合理答案或其他合理答案)PCR扩增DNA导致的多聚酶链式反应【解析】【解析】本题考查了本题考查了PCR技术的应用及相关计算技术的应用及相关计算与识图能力。与识图能力。(1)该该DNA样品复制样品复制5次，产生次，产生DNA分分子数为子数为2532个，个，DNA样品中样品中TA200个，则样个，则