抗体制备过程（精选干货）

1、抗体制备过程2l单抗技术的基本原理单抗技术的基本原理l 小鼠骨髓瘤细胞能在动物体外无限繁殖小鼠骨髓瘤细胞能在动物体外无限繁殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖，又能产生特异性抗体，可通过无限增殖，又能产生特异性抗体，可通过有限稀释法经筛选培育成由单个细胞增殖有限稀释法经筛选培育成由单个细胞增殖而成的克隆株。该克隆株如不发生变异，而成的克隆株。该克隆株如不发生变异，就可大批量的生产高特异性和高纯度的单就可大批量的生产高特异性和高纯度的单抗。抗。3l单克隆抗体的优越性单克隆抗体的优

2、越性l1. 目的性明确目的性明确 l 人们可以在动物体内或体外按自己的人们可以在动物体内或体外按自己的需要生产不同类型的单抗。任何抗原、半需要生产不同类型的单抗。任何抗原、半抗原，包括各种细菌、病毒、激素、酶类、抗原，包括各种细菌、病毒、激素、酶类、氨基酸序列、核酸，还有其它异体蛋白或氨基酸序列、核酸，还有其它异体蛋白或糖蛋白等均可以用来免疫动物，利用杂交糖蛋白等均可以用来免疫动物，利用杂交瘤技术获得相应的单抗。瘤技术获得相应的单抗。4l2. 特异性高特异性高l单抗是针对某一种特定抗原或抗原上特定决定簇制单抗是针对某一种特定抗原或抗原上特定决定簇制备的，与其它抗原无交叉反应性。与其它常规免疫备

3、的，与其它抗原无交叉反应性。与其它常规免疫血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一，血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一，便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫苗、生产生物制剂和用于基础研究的重要手段。苗、生产生物制剂和用于基础研究的重要手段。l3 .生产简单，易于标准化生产简单，易于标准化 l一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定合格后可置液氮中长期保存。如不发生变异，染色合格后可置液氮中长期保存。

4、如不发生变异，染色体不丢失，就可长久源源不断的大批生产高特异性体不丢失，就可长久源源不断的大批生产高特异性和高纯度的单抗和高纯度的单抗5单克隆抗体制备示意图单克隆抗体制备示意图6一、细胞融合前准备一、细胞融合前准备 l( (一一) )免疫方案免疫方案l选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的高质量的McAbMcAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。而定。l可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂

5、，常用佐剂：福氏可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。完全佐剂，福氏不完全佐剂。l要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。包水的状态。7l 初次免疫初次免疫 AgAg1 150g50g加福氏完全佐剂皮下多点注射加福氏完全佐剂皮下多点注射l( (一般一般0.80.81ml1ml0.2ml0.2ml点点) )l3 3周后周后l第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或第二次免疫剂量同上，加福

6、氏不完全佐剂皮下或ip)ip)l(ip(ip剂量不宜超过剂量不宜超过0.5ml)0.5ml)l3 3周后周后l第三次免疫剂量同上，不加佐剂，第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ipipl (5(57 7天后采血测其效价，检测免疫效果天后采血测其效价，检测免疫效果) )l2 23 3周后周后l加强免疫，剂量加强免疫，剂量5050500g500g为宜，为宜，ipip或或iv(iv(静脉内注射静脉内注射) )l3 3天后天后l取脾融合取脾融合8l( (二二) )饲养细胞饲养细胞l在制备单克隆抗体过程中，许多环节在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、需要加饲养细胞，如：在杂交

7、瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。是十分必要的。9l 小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠腹腔巨噬细胞的制备l小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠小鼠610周龄周龄ll拉颈处死浸泡于拉颈处死浸泡于75酒精，消毒酒精，消毒35分钟分钟ll用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜ll用无菌注射器注入用无菌注射器注入68ml培养液培养液ll反复冲洗，吸出冲洗液反复冲洗，吸出冲洗液ll放入放入10ml离心管，离心管，1200转分离心转分离心56分钟分钟ll用用20小牛血清小牛血清(NCS

8、)或胎牛血清或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数的培养液混悬，调整细胞数110mlll加入加入96孔板，孔板，100l孔孔ll放入放入37CO2孵箱培养孵箱培养10l一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得鼠可获得58106腹腔巨噬细胞，若用小腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5106ml，小鼠脾细胞为，小鼠脾细胞为1106ml，小鼠的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞(3T3)1105ml，均为，均为100l孔。孔。11l(三三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞l骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品骨髓瘤细胞

9、系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。l常用骨髓瘤细胞系有：常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。等。12l骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的培养基。小牛血清的浓度一般在浓度一般在1020，细胞的最大密度不，细胞的最大密度不得超得超10ml，一般扩大培养以，一般扩大培养以1 10稀释稀释传代，每传代，每35天传代一次。细胞的倍增时天传代一次。细胞的倍

10、增时间为间为1620小时，上述三株骨髓瘤细胞系小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。轻轻吹打即可悬起细胞。13l一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，的敏感性，每每36月应用月应用8AG(8氮杂鸟嘌呤氮杂鸟嘌呤)筛选一次，筛选一次，以防止细胞的突变。以防止细胞的突变。l保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于好的形态，活细胞计数高于95，也是决，也是决定细胞融合的关键。

11、在细胞融合的前一天定细胞融合的关键。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日，次日一般即为对数生长期细胞。一般即为对数生长期细胞。14l(四四)免疫脾细胞免疫脾细胞l免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。功率较高。l脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏

12、，用不完全的培养液洗一次，置平皿中脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为脾脏体积的倍，细胞数为10左右。左右。15二、细胞融合，选择杂交瘤二、细胞融合，选择杂交瘤l(一一)细胞融合流程细胞融合流程l(1)取对数生长的骨髓瘤细胞取对数生长的骨髓瘤细胞SP20，1000rpm离心离心5分钟，弃上清，用分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完

13、全培养液洗涤2次。次。l(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。次。l(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 10或或1 5的比例混合在一起，在的比例混合在一起，在50ml塑塑料离心管内用不完全培养液洗料离心管内用不完全培养液洗1次，次，1200rpm,8分钟。分钟。l(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。的浓度。l(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。l(6)在室温下融合可先以预热在室温下融合可先以预热40:l30秒内加入预热

14、的秒内加入预热的1ml45PEG(Merek,分子量分子量4000)含含5DMSO，边加，边加边搅拌。边搅拌。l作用作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。秒钟。l加预热的不完全培养液，终止加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔分钟分别加入作用，每隔分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和和10ml。16l(7)离心，离心，800rpm，6分钟。分钟。l(8)弃上清，先用弃上清，先用6ml左右左右20小牛血清小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。吹打，以免使融合在一起的细胞散

15、开。l(9)根据所用根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块一块96孔板。孔板。l(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，孔板，100l孔，孔，37、5CO2孵箱培养孵箱培养 (一般一块一般一块96孔板含有孔板含有1107脾细胞脾细胞) 。l（11） 第第3、6、9、10日换入含日换入含HAT的完全的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。l（12）于第）于第12、

16、15日加入含有日加入含有HAT的完全的完全1640培养液。在每次换液前用倒置培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在瘤细胞在1020天内出现，但也有在天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。后，吸取上清液，检查抗体。（13） 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全液和完全1640液而代之以液而代之以10

17、%FCS1640液。同时保存于液氮和进行克隆液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。17l(二二)HAT选择杂交瘤选择杂交瘤l一般在融合一般在融合24小时后，加小时后，加HAT选择培养液。选择培养液。HT和和HAT均有商品化试均有商品化试剂剂50贮存，用时贮存，用时1ml加入加入50ml20小牛血清完全培养液中。小牛血清完全培养液中。l因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200l孔。所孔。所以在加选择培养液时应加以在加选择培养液时应

18、加3倍量的倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的量可用全量的23进行选择，可得到满意的筛选结果。进行选择，可得到满意的筛选结果。l50HATlH:510-3MlA:210-5MlT:810-4Ml一般选择一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。培养两周，改用一般培养液。18三、抗体的检测三、抗体的检测 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂

19、交瘤细胞布满孔的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底底110面积时，即可开始检测特异性抗体，面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。筛选出所需要的杂交瘤细胞系。19四、杂交瘤的克隆化和冻存四、杂交瘤的克隆化和冻存 l克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆。要想将这些细胞彼此数个甚至更多的克隆。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对分开，就需要克隆化。

20、克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。即使克隆化过的杂交瘤细胞也细胞所抑制。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。20l1.有限稀释法的程序有限稀释法的程序l制备饲养细胞悬液制备饲养细胞悬液(同融合前准备同融合前准备)l阳性孔细胞的计数，并调细胞数在阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1510mll取取130个细胞放

21、入个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即含饲养细胞完全培养液，即20个细胞个细胞ml，100l孔加孔加A、B、C三排为每孔三排为每孔2个细胞。余下个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加细胞悬液补加2.9ml含饲含饲养细胞的完全培养液养细胞的完全培养液,细胞数为细胞数为10个个ml，100l孔加孔加D、E、F三排，为每孔三排，为每孔1个细胞。余下个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个个ml，100l孔，加孔，加G、H两排，为每孔两排，为每孔0.5个细胞。个细胞。l培养培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆

22、，补加完全培天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液养液200l孔。孔。l第第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。l注注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。21l2.软琼脂法软琼脂法l软琼脂的配制软琼脂的配制l含含20FCS(小牛血清小牛血清)的的2倍浓缩的倍浓缩的RPMI1640l1琼脂水溶液：高压灭菌，琼脂水溶液：高压灭菌，42预热。预热。l0.5琼脂：由琼脂：由1份份1琼脂加琼脂加1份含份含20小牛血清的小牛血清的2倍浓缩的倍浓缩的RPMI1640配制而成。配制而成。

23、置置42保温。保温。l用上述用上述0.5琼脂液琼脂液(含有饲养细胞含有饲养细胞)15ml倾注于直径为倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。待凝固后作为基底层备用。l按按100ml，500ml或或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。等浓度配制需克隆的细胞悬液。l1ml 0.5琼脂液琼脂液(42预热预热)在室温中分别与在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。不同浓度的细胞悬液相混合。l混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于分钟，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。孵箱中。l45天后即

24、可见针尖大小白色克隆，天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养细胞的天后，直接移种至含饲养细胞的24孔孔板中进行培养。板中进行培养。l检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。22l(二二)杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存l及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没

25、有原始细胞的的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。l杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。l细胞冻存液细胞冻存液:l50小牛血清小牛血清l40不完全培养液不完全培养液l10DMSO(二甲

26、亚砜二甲亚砜)23五、单克隆抗体的大量生产五、单克隆抗体的大量生产l大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：l1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费，如果大量生产，费用较高。用较高。l2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。l实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按13107ml接种于小鼠背接种于小鼠背部皮下，每处注射部

27、皮下，每处注射0.2 ml, 共共24点。待肿瘤达到一定大小后点。待肿瘤达到一定大小后(一般一般1020天天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。但采血量有限。l腹水的制备常规是先腹腔注射腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷降植烷)或液体石腊于或液体石腊于BaLbc鼠，鼠，12周后腹腔注射周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含腹水。也可用注射器抽取