胶原蛋白的制备与鉴定

1、赵腾飞、刘强、海振宇、陈强、毕晨曦、邵德魁、柴小伟、张荣彬赵腾飞、刘强、海振宇、陈强、毕晨曦、邵德魁、柴小伟、张荣彬 一、引言 二、胶原蛋白的提取 三、胶原蛋白的鉴定 四、结束语一、引言 胶原是生皮中最主要的纤维蛋白，是动物皮肤的主要成分。除此之外，动物的骨、齿、肌腱、韧带、软骨、血管等组织中都存在胶原。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%30%，在真皮蛋白质中，胶原占85%90%。 随着时代和科学技术的发展，人们在探讨胶原的化学、物理、生物学性质的过程中，逐渐认识和开辟着胶原广泛应用的新领域以求开发具有高附加值的胶原新产品 尤其是当人们认识到胶原具有其它高分子材料无可

2、比拟的弱的抗原性、生物相容性和生物降解性时，人们更意识到胶原作为生物材料在医药、仪器、化妆品、饲料肥料等工业中的重要性。动物皮的水解产物利用 通过酸、碱、酶的作用对动物皮进行水解，可以得到不同分子质量的产物，包括胶原、明胶、水溶性明胶、多肽、短肽和氨基酸。对这些物质进行恰当的分离，得到所要的产物。 一般有以下用途：1、可注射胶原2、止血胶原海绵、敷料3、手术缝线与医用纤维 二、提取2.1、胶原蛋白的结构a电镜下胶原纤维呈明暗交替的条纹图案；b胶原纤维中原胶原分子的排列；c原胶原分子是一种右手三股螺旋；d三股螺旋中的每股链是左手螺旋；e三股螺旋的原胶原分子水平模型 胶原蛋白的分子结构单元是原胶原

3、。 原胶原为细长的棒状分子，由三条肽链构成。每条肽链由1000 个以上的氨基酸残基构成，不含色氨酸，其中脯氨酸是胶原特有的氨基酸。胶原蛋白中甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量高，不能形成 螺旋或 折叠片结构，而是形成以三条称为 肽链或 链的多肽链（亚基）缠绕成特有的三股螺旋。虽然各种类型的胶原蛋白都具有相似的螺旋结构特征，但组成胶原蛋白的各多肽链的结构有很大的差别。 以 型胶原为例，其一级结构，胶原中含有较为伸展的左手螺旋区段以及非螺旋区段，在螺旋区段中则呈现出了（gly- x- y）n（其中x，y 代表非甘氨酸）的周期性排列。 二级结构则由三条呈左手螺旋的肽链形成的右手大螺旋（如右图所示）。三股螺

4、旋分子间以一定间距、呈纵向对称交错排列形成原纤维，再聚集成纤维，然后形成更大的纤维束。2.2、胶原蛋白的提取 提取一般由下列步骤组成： 萃取、分离、提纯 2.2.1、萃取 萃取具体操作方式和控制条件因皮源的不同而有所差异。以下是几种常用的方法: 酸法提取 碱法提取 酶法提取 此外，还有酸酶结合法、酸碱结合法、酸碱与热水结合法等。（1）酸法提取主要影响因素例证原理及常用材料酸法提取是用酸浸泡预处理后的材料，再经离心等操作提纯的提取方法。常用的酸有：乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸、醋酸以及乳酸等 .在影响酸法提取的诸多因素中，ph 的影响不大，但ph 值过小胶原大分子带正电荷，因电荷之间的排斥作用使胶原

5、不能形成稳定的凝胶；动物皮的种类以及对皮的预处理也是重要影响因素之一；酸的种类和浓度、以及提取温度和时间影响都较大。一般情况下，提取率随温度升高、时间延长而提高，但时间过长或温度过高导会导致胶原变性从而使提取率降低。.1 叶易春等通过对酸法提取猪皮胶原分析得出：酸法提取时，提取时间不同，其相对分子量及分布基本相同 2 户业丽等以酸法提取鲟鱼皮胶原蛋白，通过正交试验得出：乳酸较乙酸、柠檬酸提取率高；随着乳酸浓度的增加，胶原蛋白的提取率也随之增加，但当浓度超过1 mol/l 后，由于胶原蛋白变性导致提取率下降；在一定范围内浸提时间越长，胶原提取率增加越快，而后趋于平稳，最后还有可能会降低。其实验得

6、出对胶原提取率的影响程度：酸浓度提取时间温度固液比。 采用该法能有效胡提高提取率，但只能得到相对分子量较小的胶原蛋白水解产物，应用价值并不太高。与其他提取法相似，提取时间的延长在一定范围内可以使提取率增加。 用碱溶解预处理后的材料，从而达到提取胶原蛋白的目的。预处理时除去皮中的脂肪、污渍、杂质等越好，就越有利于胶原蛋白的提取。已经有人以碱法提取皮革废弃物中的胶原蛋白，其中最关键的是脱铬。 影响碱法提取的因素主要有碱浓度、提取温度、预处理、ph 以及时间。一定范围内提高碱浓度有利于提高胶原蛋白提取率。一定范围内提高温度，有利于水解得到相对分子量较小的胶原产物，但超过范围会导致胶原的生物活性丧失。

7、 （2）碱法提取原理原理优劣势优劣势影响因素影响因素（3）酶法提取原理原理发展发展预处理预处理主要因素主要因素工艺特点工艺特点酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂，溶解材料，再经过其他操作提取胶原蛋白。 目前国内采用酶法提取胶原时的水解温度基本在50 以上或4 以下，而胶原在3738 以上就会变性，生成明胶，故较高温度下的提取物为变性胶原，其进一步应用受到限制13。低温下虽然有助于胶原结构的完整，但酶解时间长。 预处理是除去皮源中的不同杂物，如钙物质、脂肪等，以便后续操作，得到更多更纯的胶原。李国英等在通过优化预处理来提取胶原的研究中指出：对比而言，预处理主要集中在去钙上，因为那些无机物质中

8、最主要的成分是钙，钙会降低胃蛋白酶活性从而影响胶原提取率。可见预处理对于胶原提取率的影响较大。影响因素主要有酶的用量、水解ph、水解时间、以及水解温度。工艺为：预处理酶解盐析透析冷冻干燥。用酶解法提取胶原蛋白是目前比较理想的手段，它具有反应快、时间短、对环境友好，提取胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定等特点 （4）影响因素分析 皮源 预处理情况 提取液浓度 ph 提取温度 提取时间 有的还有提取液固液比、提取工艺等2.2.2、分离分离是对提取得得胶原溶液中各类胶原进行初步分级（1）盐析分级盐析分级是常用的分离方法：恰当地控制溶液的盐浓度，使特定的胶原析出。（2）热胶化分离利用不同类型的胶原

9、可胶化性的差异，使得部分胶原被胶化而与其他胶原分离的方法。（3）变形和复性分离已知含双硫键的分子在变性后的复性要比不含双硫键的快的多。i型与ii型胶原的分离，可以利用这一性质。2.2.3、提纯 经过提取和分离得到的胶原样品仍在不同程度上含有其他类型的胶原，此外，还携带有某些类粘蛋白、球蛋白杂质，需经过进一步提纯。胶原蛋白的提纯主要使用层析方法，如离子交换层析和凝胶过滤层析等。三、胶原蛋白的鉴定1、胶原蛋白的定量 蛋白质的定量是研究蛋白质的基本步骤，定量研究的数据是其它进一步研究的基础,定量测定蛋白质的浓度的方法很多,有凯氏定氮法双缩脲法、福林酚法和紫外光吸收法、考马斯亮蓝法、氨基酸分析法。胶原

10、蛋白的定量分析胶原蛋白的定量分析凯氏定氮法双缩脲法 考马斯亮蓝g250法 福林酚法 光吸收法 虽有普遍性,但操作繁琐费时 将一定量的蛋白质用浓硫酸消化分解使其中的氮变成铵盐变氮为氨与浓naoh作用使氨气释放出后硼酸标准溶液吸收再用标准酸直接滴定或用标准酸液吸收氨气后用反滴定法滴定残留的酸吸收氨条件求得该蛋白质样品中的含氮量再通过换算得知样品中的蛋白质含量计算凯氏定氮法测量氨的含量转化蛋白质中的氮计算蛋白质都有其恒定的含氮量(约1416), 光吸收法光吸收法由于蛋白质含有芳香族氨基如由于蛋白质含有芳香族氨基如色氨酸色氨酸(trp)和酪氨酸和酪氨酸(tgr)，故在，故在280nm有吸有吸收最大峰。

11、用收最大峰。用280nm光吸收值可定量光吸收值可定量测定该种蛋白质的量，但是每种蛋白测定该种蛋白质的量，但是每种蛋白质中的芳香族氨基酸含量不同，故采质中的芳香族氨基酸含量不同，故采用用280nm光吸收为光吸收为1时，吸光度等于时，吸光度等于1mg/mi来计算另由于核酸类杂质在来计算另由于核酸类杂质在280nm也有光吸收为了排除其扰采也有光吸收为了排除其扰采用用280nm和和260nm光吸收值用下式计光吸收值用下式计算蛋白质浓度算蛋白质浓度(mg/mi)=145a074a。最难确定的方法是用蛋白质的摩尔吸最难确定的方法是用蛋白质的摩尔吸光系数计算精确称取光系数计算精确称取1mg10mg已恒已恒重

12、过的纯蛋白的样品重过的纯蛋白的样品.配成配成1mgmi浓浓度的样品测其在度的样品测其在280nm下的光吸收下的光吸收值可得出该蛋白质的克分子消光系数值可得出该蛋白质的克分子消光系数光吸收法，测定迅速用量少不消耗样光吸收法，测定迅速用量少不消耗样品故被广泛采用但必须注意该法仅品故被广泛采用但必须注意该法仅适用于适用于纯蛋白样品纯蛋白样品。其他方法双缩脲法 该方法的原理是基于胶原蛋白质分子中的肽键co nh在碱性溶液中与cu络合呈蓝色的双缩脲反应。该方法受蛋白质的特异性影响较小适用于较大量胶原蛋白质(毫克级)的定量测定。福林酚法 优点:灵敏度高,重复性好.颜色深,析光度大.缺点:试剂配制麻烦.尽管

13、该法灵敏度和准确度都较高，但操作较繁琐并且影响因素较多而受到局限考马斯亮蓝g250法 该方法适合于定量测定范围是10mg100mg操作简单应用广泛2 2、蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度蛋白质的纯度质谱质谱 氨基酸定氨基酸定量分析量分析 分析电泳分析电泳等电点等电点等电点 一种蛋白质只有一个等电点一种蛋白质只有一个等电点测定等电点的具体方法有所不同，即测定等电点的具体方法有所不同，即使同一种蛋白质的等电点也会不同使同一种蛋白质的等电点也会不同故应是在同一种测定方法下进行比较故应是在同一种测定方法下进行比较对某些产品的纯度鉴定时，虽然用对某些产品的纯度鉴定时，虽然用 某些方法证明是纯

14、的但在等电点聚某些方法证明是纯的但在等电点聚集分析时出现较多的条带集分析时出现较多的条带 1和标样的氨基酸组成相比较以确认样品的氨基酸组成是与和标样的氨基酸组成一样 氨基酸定量分析氨基酸定量分析 2如果是种未知蛋白质 则 到 其 数 据 库(protcndatabank)去查阅比较是否与已知蛋白质的氨基酸组成相似以确定样品是否是一种的蛋白质氨基酸 四、结束语 皮胶原因其良好的生物学特性在生物材料领域具有广泛的应用前景。长期以来,研究人员不断地探索、改进皮胶原的提取工艺,但至今仍存在着原料耗量高、时间长、产率低等问题,制约了皮胶原的深度开发与应用。 因此,如何优化工艺条件提高皮胶原的提取纯度,并且在保证其纯度的前提下尽可能地提高产率