蛋白质工程课件

1、蛋白质工程1蛋白质工程蛋白质工程Protein engineering 蛋白质工程2Protein engineering蛋白质工程是应用科学，蛋白质工程是应用科学，目的是获得目的是获得有用或有价有用或有价值的蛋白质。值的蛋白质。这是一个年轻的学科，目前，蛋白质工程尚未有这是一个年轻的学科，目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学学科

2、基础上，融合了蛋白质生物学、分子遗传学学科基础上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域蛋白质工程3蛋白质工程4蛋白质工程进展蛋白质工程进展 蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。 福什特（福什特（ForshtForsht）等在）等在19851985年间对酪氨酰年间对酪氨酰tRNAtRNA合成合成酶的分子改造工作。酶的分子改造工作。19871987年枯草杆菌蛋白酶改造活年枯草杆菌蛋白酶改造活力提高力提高1010倍。倍。 佩里

3、（佩里（PerryPerry）19841984年溶菌酶分子改造使酶热稳定年溶菌酶分子改造使酶热稳定性提高。性提高。 。 蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。蛋白质工程5蛋白质工程的前景蛋白质工程的前景 蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。的前景。 例

4、如，科学家通过对胰岛素的改造，已使例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。其成为速效型药品。 生物材料科学家正积极探索将蛋白质工程生物材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。应用于微电子方面。 用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。极为广阔的发展前景。蛋白质工程6实际应用实际应用 提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 融合蛋白质融合蛋白质 蛋白质活性的改变蛋白质活性的改变 治疗酶的改造治疗酶的改造 嵌合抗体和人缘化抗体嵌合抗体和人缘化抗体 蛋白质

5、工程7蛋白质工程的研究策略蛋白质工程的研究策略蛋白质工程8蛋白质工程的基本途径蛋白质工程的基本途径 蛋白质结构分析蛋白质结构分析 结构、功能的设计和预测结构、功能的设计和预测 创造和改造创造和改造 蛋白质工程9两个战略两个战略合理设计合理设计 蛋白质计算蛋白质计算机机设计。使用计算设计。使用计算机机的方的方法设计蛋白质是最具挑战性的法设计蛋白质是最具挑战性的工作工作。 技技术术：定点突变定点突变定向进化。定向进化。蛋白质工程10蛋白质结构分析蛋白质结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功蛋白质分子结构的信息，以

6、便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。之间关系的理论研究奠定基础。 国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发开发 具有高度专一性的药用蛋白质。具有高度专一性的药用蛋白质。 蛋白质工程11结构、功能的设计和预测结构、功能的设计和预测 根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结构和

7、生物功能；可以根据特定的生物功能，设计构和生物功能；可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验直接考察分析结构与功能之间的关系；等实验直接考察分析结构与功能之间的关系； 通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论

8、来解释结构与功能之间的关系，一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。用以设计、预测蛋白质的结构和功能。 蛋白质工程12计算机辅助蛋白质设计计算机辅助蛋白质设计 计算机辅助蛋白质设计（）是指在计算机辅助蛋白质设计（）是指在蛋白质工程中，应用计算机技术，通过对已蛋白质工程中，应用计算机技术，通过对已知的蛋白质顺序、分子构象、结构与功能关知的蛋白质顺序、分子构象、结构与功能关系等数据的分机处理，预测和评估蛋白质改系等数据的分机处理，预测和评估蛋白质改造中各种方案，做出最佳选择，具体地讲，造中各种方案，做出最佳选择，具体地讲，是蛋白质工程中蛋白质设计的软件的研究。是

9、蛋白质工程中蛋白质设计的软件的研究。 研究的内容也就是应用软件的开发，研究的内容也就是应用软件的开发，包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计模拟模型的建立以及计算机程序编写和软件模拟模型的建立以及计算机程序编写和软件可用性的研究可用性的研究蛋白质工程13Protein design Protein design is the design of new protein molecules from scratch, or the deliberate design of a new molecule by making calculated variati

10、ons on a known structure. Protein design requires an understanding of the process by which proteins fold. by use of computer models, Protein design is also referred to as inverse folding. Hence, designing a new protein involves the identification of the sequences which have the chosen structure as f

11、ree energy minimum. 蛋白质工程14蛋白质创造和改造蛋白质创造和改造 蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋

12、白质发接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。生胶连等等。基因重组技术基因重组技术：如：如定位突变技术定位突变技术，盒式突变盒式突变，PCR技术技术蛋白质工程15定向进化定向进化Directed evolution 定向进化是一种用在蛋白质工程定向进化是一种用在蛋白质工程中的方法中的方法 利用定向进利用定向进得到得到在自然界中在自然界中未发现未发现发现蛋发现蛋白质或白质或RNARNA。蛋白质工程16定向进化定向进化实验步骤实验步骤 多样化多样化，Diversification:Diversification: 在此步骤中常用的在此步骤中常用的技术技术是是易错易错PCRPCR和和DNA

13、DNA改组。突变改组。突变库库 选择选择，Selection: Selection: 理想突变理想突变的扫描的扫描或选择。或选择。 扩增，扩增，Amplification:Amplification:确定的突变复制确定的突变复制扩增扩增，了解了解DNADNA序列序列的的突变。突变。 这三个步骤称为一个这三个步骤称为一个“回合回合”定向进化。大多定向进化。大多数实验结果将执行一个以上的回合。上一轮的数实验结果将执行一个以上的回合。上一轮的结果结果供下供下轮创建一个新轮创建一个新库库。在实验结束，蛋白。在实验结束，蛋白质或质或RNARNA突变采用生化方法突变采用生化方法鉴定鉴定。蛋白质工程17定向

14、进化定向进化与与自然进化自然进化蛋白质工程18自然进化自然进化 自然进化自然进化是是环境压力下物种朝着适应生存环境压力下物种朝着适应生存 环境的方向发展环境的方向发展 自然进化自然进化是是漫长时间里通过漫长时间里通过DNADNA复制发生突复制发生突变或通过重组，变或通过重组， 自然进化自然进化是是产生了遗传多样性产生了遗传多样性 自然进化自然进化是是自发、非常缓慢、自然选择自发、非常缓慢、自然选择蛋白质工程19定向进化定向进化 定向进化定向进化在实验室中模仿自然进化在实验室中模仿自然进化 定向进化定向进化的关键步骤：突变、重组和筛选，的关键步骤：突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化

15、过程，在较短时间内完成漫长的自然进化过程， 定向进化定向进化有效改造蛋白质，使之适于人类有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。的需要。蛋白质工程20定向进化与自然进化的差别定向进化与自然进化的差别蛋白质工程21定向进化的一般过程定向进化的一般过程蛋白质工程22酶定向进化的意义定向进化的意义 酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。多性质不适应工业生产的条件。 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐

16、设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。要。蛋白质工程23酶分子定向进化的历史酶分子定向进化的历史 Sol Spiegelman在在20世纪世纪60年代利用年代利用RNA噬菌体噬菌体Q进行实验，是进行实验，是第一次在分子水平上第一次在分子水平上定向改造单一分子。定向改造单一分子。蛋白质工程24RNA噬菌体噬菌体Q蛋白质工程25定向进化的历史定向进化的历史 19811981年，年，B.G.HallB.G.Hall等定向改变等定向改变E.coliK12E.coliK12中中ebgebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解酶

17、的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。能力的酶。 19931993年，年，ArnoldArnold研究组提出易错研究组提出易错PCRPCR的方法。的方法。 19941994年，年，StemmerStemmer将将DNADNA重组方法引用到酶分子重组方法引用到酶分子的定向进化中。的定向进化中。 19991999年，年，StemmerStemmer等把等把DNADNA改组延伸到族改组。改组延伸到族改组。蛋白质工程26定向进化的历史定向进化的历史蛋白质工程27酶定向进化的过程 酶定向进化通常分酶定向进化通常分3 3步进行：步进行： 通过随机突变和通过随机突变和( (或或) )基因体外重组创

18、造基基因体外重组创造基因多样性；因多样性； 导入适当载体后构建突变文库；导入适当载体后构建突变文库； 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可通过灵敏的筛选方法，选择阳这个过程可通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。重复循环，直至得到预期性状性突变子。重复循环，直至得到预期性状的酶。的酶。蛋白质工程28多样性的产生多样性的产生蛋白质工程29定向进化的策略定向进化的策略n无性进化无性进化 易错易错PCRPCR、化学诱变剂介导的随机诱变、化学诱变剂介导的随机诱变、 由致突变菌株产生的随机突变由致突变菌株产生的随机突变n有性进化有性进化 DNADNA改组技术、

19、随机引物体外重组法、交改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法错延伸法蛋白质工程30易错易错PCR(error-prone PCR)PCR(error-prone PCR) 一种相对简单、快速廉价的随机突变方法一种相对简单、快速廉价的随机突变方法 通过改变通过改变PCRPCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。基错配，从而导致目的基因的随机突变。 关键是控制关键是控制DNADNA的突变频率。的突变频率。 此法的不足之处：此法的不足之处： 靶序列长度一般在靶序列长度一般在0.5-1.0kb0.5-1.0kb，应用范围有限；，应用范围

20、有限； 中性突变较多；中性突变较多； 较为耗时、费力较为耗时、费力； 获得的获得的DNADNA序列中碱基的转换高于颠换。序列中碱基的转换高于颠换。 此法突变具有一定的密码偏向性。此法突变具有一定的密码偏向性。蛋白质工程31易错易错PCRPCR蛋白质工程32连续易错连续易错PCRPCR(Sequential error-prone PCR) 该方法是将一次该方法是将一次PCRPCR扩增得到的有益突变扩增得到的有益突变基因作为下一次基因作为下一次PCRPCR扩增的模板，连续扩增的模板，连续反复进行随机诱变，反复进行随机诱变，使得每一次获得的使得每一次获得的少量突变累积而产少量突变累积而产生重要的有

21、益突变。生重要的有益突变。蛋白质工程33DNADNA改组技术改组技术(DNA shuffling)(DNA shuffling) 又称有性又称有性PCRPCR，指，指DNADNA分子的体外重组，是分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有的通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予表达产物核苷酸序列创造新基因，并赋予表达产物以新功能。以新功能。 分子育种分子育种蛋白质工程34DNA改组原理改组原理1.DNaseI1.DNaseI产生随机片段；产生随机片段；2.2.随机片段变性随机片段变性；3.3.随机

22、片随机片段复性；段复性；4.4.延伸延伸延伸延伸22-4422-44步后可获得全步后可获得全DNADNA片段片片段片段段蛋白质工程35单个基因的单个基因的DNA改组改组 从突变体基因库中分从突变体基因库中分离出的离出的DNADNA片段用脱片段用脱氧核糖核酸酶氧核糖核酸酶I I随机随机切割得到的随机片段切割得到的随机片段 经过不加引物的多次经过不加引物的多次PCRPCR循环循环 在在PCRPCR循环过程中，循环过程中，随机片段之间互为模随机片段之间互为模板和引物进行扩增，板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，直到获得全长的基因， 这导致来自不同基因这导致来自不同基因片段之间的重组片段之间的重组蛋

23、白质工程36基因家族改组技术基因家族改组技术(family shuffling)蛋白质工程37 采用基因家族的改采用基因家族的改组效果明显高于单组效果明显高于单个基因的改组效果。个基因的改组效果。特点特点 改组基因的效率高改组基因的效率高 提高基因突变机率提高基因突变机率基因家族改组基因家族改组蛋白质工程38蛋白质工程39随机引物体外重组法随机引物体外重组法(RPR)(RPR)蛋白质工程40交错延伸原理交错延伸原理蛋白质工程41DNADNA改组与常规定向进化的比较改组与常规定向进化的比较蛋白质工程42基因文库的构建基因文库的构建 构建理想的基因文库要考虑的因素：构建理想的基因文库要考虑的因素：

24、 基因文库的质量基因文库的质量 (1) (1) 文库的代表性文库的代表性 (2) (2) 突变基因片段的序列完整性突变基因片段的序列完整性 文库筛选可选择的方法文库筛选可选择的方法 控制突变库的大小与特定的筛选容量相适控制突变库的大小与特定的筛选容量相适应应蛋白质工程43突变体基因的构建策略突变体基因的构建策略 DNADNA随机酶切随机酶切，片段拼接片段拼接 单链单链DNADNA随机拼接（提高不同亲代基因的同随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌合体基因的效率）源片段重组形成嵌合体基因的效率） 限制性酶切片段随机拼接（防止限制性酶切片段随机拼接（防止PCRPCR扩增产扩增产生相同的亲代

25、基因）生相同的亲代基因）蛋白质工程44构建突变基因文库的载体系统构建突变基因文库的载体系统 噬菌体载体系统基因文库噬菌体载体系统基因文库：构建中最早使用构建中最早使用插入片段的装载容量大，适合大片段克隆插入片段的装载容量大，适合大片段克隆构建出的基因文库质量高、代表性好构建出的基因文库质量高、代表性好适合长期保存适合长期保存主要缺点是构建成基因文库后，可采用的主要缺点是构建成基因文库后，可采用的文库筛选方法有限文库筛选方法有限蛋白质工程45质粒载体系统质粒载体系统 质粒载体系统质粒载体系统： 优点优点体外操作简便，体外操作简便，载体本身的设计上有很大可塑性载体本身的设计上有很大可塑性能实现对基

26、因文库的功能性筛选能实现对基因文库的功能性筛选 缺点缺点插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失隆在文库的群体扩增过程中容易丢失转化效率普遍较低转化效率普遍较低不适合文库的长期保存不适合文库的长期保存蛋白质工程46文库的筛选 建立有效的搜索文库的方法是影响定向进建立有效的搜索文库的方法是影响定向进化成功与否的关键化成功与否的关键 采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关的性质相关 借助检测仪器易实现高通量筛选借助检测仪器易实现高通量筛选蛋白质工程47定向进化的筛选定向进化的筛选

27、 活体筛选法活体筛选法- -基于表形观察的筛选基于表形观察的筛选 基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库 噬菌体显示法；噬菌体显示法； 细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面） u筛选方法根据各个蛋白质的性质而设筛选方法根据各个蛋白质的性质而设，筛选方法筛选方法根据各个蛋白质的性质而设因此，不具有通用性。根据各个蛋白质的性质而设因此，不具有通用性。u突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型和能通过定量表征的筛选手段紧密联系。和能通过定量表征的筛选手段紧密联系。u为加快分离目的基因的

28、过程，已建立起多种在基为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基因发现上具有因发现上具有“高通量高通量”性能的筛选方法。性能的筛选方法。蛋白质工程48高通量筛选技术高通量筛选技术 突变微生物分离突变微生物分离 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌通过琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。的出现等判断是否具有目的基因。 微球细胞固定法与数字成像系统结合微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。离和筛选。 流式细胞计数法流式细胞计数法:细胞经荧光染色后，通过细胞经荧光染色后，通过 高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细 胞计数仪进行测定。胞计数仪进行测定。蛋白质工程49酶活力检测酶活力检测 反应产物反应产物：显色显色pHpH指示剂显色指示剂显色pHpH指示剂显指示剂显色色，分光光度计和荧光酶标仪分光光度计和荧光酶标仪 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测测：GC/HPLCGC/HPLC，使