实验室论文PPT

1、卡氏住白细胞虫、隐孢子虫文章汇总 姓名：王明威2016年7月23日 卡氏住白细胞虫文章一目录目录 隐孢子虫文章二卡氏住白细胞虫文章ABcDEF A 复方泰灭净对蛋鸡卡氏住白细胞虫病预防效果A A组组（169169只鸡）只鸡）B B组组（159159只鸡）只鸡）对照组对照组（172172只鸡）只鸡）血涂片、琼脂血涂片、琼脂扩散法化验扩散法化验产蛋及存活产蛋及存活观察观察实验结果实验结果实验材料和方法实验材料和方法高产海兰白鸡、卡氏住白细胞虫标准抗原、标准阳性抗体血涂片、琼脂血涂片、琼脂扩散法化验扩散法化验血涂片、琼脂血涂片、琼脂扩散法化验扩散法化验30 g/L复方泰灭净50 g/L复方泰灭净统计

2、分析复方泰灭净 50 g/ L 组对卡氏住白细胞虫的感染完全保护, 整个试验期间血涂片和琼脂扩散检查均为阴性。 30 g/ L 组基本能够控制其感染, 整个试验期间仅检出 1例抗体阳性, 感染率为 0. 63% ( 1/ 160), 同时未见临床症状。对照组蛋鸡从 5 月份开始至实验结束连续发病并出现血清学阳性反应, 抗体检出率为 27.80% 80. 00%, 抗原检出率为 0. 68%( 1/ 158), 裂殖子检出率为 0. 63% ( 1/ 158), 并且出现大量死亡。 B 卡氏住白细胞虫子孢子冻存方法及感染力试验实验材料和方法实验材料和方法 32 35 日龄的健康 AA 鸡、患卡氏

3、住白细胞虫病鸡 诱捕诱捕 库蠓库蠓库蠓库蠓匀浆匀浆 子孢子孢子纯子纯化化A A途途径子径子孢子孢子B B途途径子径子孢子孢子病鸡玻璃匀浆器营养液A组（6只）B组（6只）C组（6只）D组（6只）注射新鲜子孢子A类子孢子观察临床症状B类子孢子抹片、染色、镜检第13天注：每组鸡中每两只鸡分别注射0.1ml、0.2、0.3ml实验结果实验结果 静脉接种未经冻存的新鲜子孢子的鸡全部发病，且随着接种剂量增加，病情亦加重。经 A 途径缓慢冻存的子孢子在较大剂量时可引起鸡发病；经 B 途径冻存的子孢子无论剂量大小均不能引起鸡发病。结论：子孢子的保存应选择A 途径, 而人工发病试验最好使用新鲜的子孢子进行接种。

4、A冻存法B冻存法 C 卡氏住白细胞虫配子体的浓集和纯化实验材料和方法实验材料和方法4只患卡氏住白细胞虫病鸡分离分离液的液的制备制备样本样本收集收集处理处理单密单密度分度分离法离法 多密多密度分度分离法离法配子配子体纯体纯化化计数计数统计统计方法方法实验结果实验结果图 1 采用多密度法纯化 的配子体（1000X）图 2 采用单密度法浓集 的配子体（1000X）图 3 浓集后进一步纯化的配子体（1000X）图 5 鸡外周血液中的 卡氏住白虫配子体 （1000X）实验结论：该二种方法均取得了较好的分离和纯化效果,达到了直接从鸡血液中分离纯化配子体的目的, 纯化的虫体纯度已基本符合虫体代谢、抗原分析及

5、核酸分析研究等工作的要求。 D PCR Amplication and Sequencing of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryi。MATERIALS AND METHODSDiseased chickens (the huge schizonts were isloated from muscle ,heart, liver, and other tissues.DNA extracte PCRamplification cloningsequencing analysisITS-2DNA UNIQ-5 spin column purificati

6、on kiturRESULTSPCR Amplication of ITS-2 rDNA of Leucocytozoon caulleryiRestriction patternof recombinant plasmid E 卡氏住白细胞虫 rDNA ITS-2 的 PCR扩增与测序实验材料和方法实验材料和方法广州某鸡场病死鸡（从肌肉组织及心脏等部位采集卡氏住白细胞虫巨型裂殖体）卵囊卵囊纯化纯化DNADNA提取提取ITS2ITS2PCRPCR扩增扩增 鉴定鉴定回收回收产物产物克隆克隆筛选筛选DNADNA测序测序分析分析实验结果实验结果1. 虫体扩增片段; 2. 鸡肌肉扩增片段; 3. 空白

7、对照1. SalI 酶切重组质粒; 2. 重组阳性质粒; 3. EcoRI 酶切重组质粒结论：根据上述比较分析，本试验所测为卡氏住白细胞虫的 ITS-2 及部分 5. 8S 和28S( ITS2+ ) 序列，其中 ITS-2 序列为卡氏住白细胞虫种特异性序列。 F 卡氏住白虫病 PCR 诊断方法的建立实验材料和方法实验材料和方法卡氏住白虫虫体材料（采自广州花都某鸡场病鸡）、 微孢子虫DNA、 弓形虫 DNA、 疟原虫DNA、荒川库蠓 DNA。卵囊卵囊纯化纯化虫体虫体DNADNA提取提取引物引物设计设计稀释稀释 ITS2ITS2PCRPCR扩增扩增产物产物回收回收测序测序特异特异性试性试验验敏感

8、敏感性实性实验验实验结果实验结果PCRPCR条件条件优化优化图 1 氏住白虫ITS-2 扩增结果图 2 特异性试验图 3 敏感性试验1.卡氏住白虫 PCR 扩增产物 2.肌肉对照组 3.空白对照组1. 卡氏住白细胞虫 2.健康肌肉 3.鸡球虫 4.荒川库蠓 5.健康鸡血液 6.微孢子虫 7.弓形虫 8.原虫1.10ng/l 2.1ng/ l 3.100pg/l4.10pg/l 5.1pg/ l 6.100fg/ l 7.10fg/ l 8.1fg/ l DNA隐孢子虫文章ACIBDEFGHJKO A 广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查实验材料和方法实验材料和方法1087头奶牛新鲜粪便（广东）。

9、实验结果实验结果饱和蔗糖漂浮法 改良抗酸染色法形态学鉴定评判标准图1 乳牛隐孢子虫卵囊改良抗酸染色的形态学观察 1 000图2 乳牛隐孢子虫卵囊直接涂片的形态学观察 1 000结论：初步鉴定为鼠隐孢子虫( C. muris) 。结论：乳牛年龄越小,感染率越高 ,感染强度越大。并且明隐孢子虫感染在一定程度上受季节性变化的影响 ,但影响不是很大。 B 安氏隐孢子虫 PCR 检测方法的建立实验材料和方法实验材料和方法安氏隐孢子虫卵囊、微小隐孢子虫、弓形虫、大肠杆菌、球虫、圆孢子虫 、 纤毛虫、肝片吸虫 、 血矛线虫和莫尼茨绦虫、牛粪便。虫体、对虫体、对组组DNADNA提取提取测定测定HSP70HSP

10、70扩增扩增退火温度退火温度筛选筛选HSP70HSP70克克隆与鉴定隆与鉴定 引物设计引物设计与合成与合成特异、敏感特异、敏感性试验性试验实验结果实验结果图 1 安氏隐孢子PCR 检测的特异性试验结果。图 2 安氏隐孢子虫PCR 检测的敏感性试验结果结果：仅安氏隐孢子虫样品DNA 扩增出约500 bp 的特定片段, 特异性良好，当样本中含有DNA 含量 1.5210 - 1 ( ng/ L) 包含 4. 45 10 2 个隐孢子虫的DNA 时,即可扩增产生清晰可辩的条带，说明该方法灵敏性高。 C 安氏隐孢子虫内转录间隔区I （ITS-1） 序列的PCR扩增、克隆及分析卵囊卵囊纯化纯化DNADN

11、A提取提取PCRPCR扩增扩增产物产物克隆克隆质粒质粒鉴定鉴定ITS1ITS1测序测序分析分析实验结果实验结果实验材料和方法实验材料和方法安氏隐孢子虫卵囊GD株（广东奶牛场）、HN株（郑州奶牛场）以及AH株（安徽农大）。M1 2 3 4 5bp20001000750500100 M 1 2 3 4bp20001000750500100M1 1 2 3 M2 bp20001000750500100500025001000250图1 C.andersoni ITS-1 PCR产物 琼脂糖电泳分析 图2 C.andersoni ITS-1 重组质粒 PCR鉴定图3 C.andersoni ITS-1

12、 重组质粒 EcoR I酶切鉴定1. GD株 2. HN株 3. AH株 4. 宿主对照 5.空白对照测序结果1. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA 652. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA3. CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA1. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATT

13、AGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT 1302. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT3. AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT1. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA 1952. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAA

14、GGACTTTGCA3. AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA1. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT 2602. AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTT AGGGGTTTTCTT3. AGCTAAATATTCATTTTAGGGAAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATCTTT AGGGGTTTTCTT1. ATTTTTTT

15、AAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA 3212. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT ATAATCTCTA3. ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTT GTAATCTCTA 图4 C.andersoni ITS-1 核酸序列的比较1.GD株，2.HN株，3.AH株；“A”，“C”及“G”代表DNA变异位点结果：GD株、HN株和AH株的ITS-1序列基本一致，仅AH株有三个碱基差异；但与GenB

16、ank上注册的C.muris和C.parvum存在种间差异，而且差异显著。 D Molecular Identification and Characterization of Cryptosporidium spp. from Mainland China。MATERIALS AND METHODSCryptosporidium oocysts（dairy cows in Guangdong, Anhui and Jiangsu provinces）DNA extracte PCRamplificationPurification cloningsequencing analysisSSU

17、rRNA and HSP70DNA UNIQ-5 spin column purification kiturRESULTSM: DG005 marker; 1: Guangdong isolate; 2: Anhui isolate; 3: Jiangsu isolate; 4: No-DNA control450bp290bp(HSP70)(SSU rRNA)Table The length and base composition of the HSP70 and the SSU rDNA sequences representing Cryptosporidium spp. from

18、ChinaSpecies Host Geographicalorigin Length (bp) A+T contents (%) Accession NoHSP70C.andersoniC.andersoniC. parvumSSU rDNAC.andersoni C.andersoni C. parvum Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Dairy cow Guangdong, ChinaAnhui, ChinaJiangsu, China Guangdong, ChinaAnhui, ChinaJiangsu, Chin

19、a 44644644629029129261.6561.6560.5365.1665.6269.85AJ567386AJ567387AJ567388AJ567389AJ567390AJ567391E 安氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的初步应用XXXX年实验材料和方法实验材料和方法 PCR检测试剂盒、234份奶牛粪样（广东、河南）。改良抗酸染色法 饱和蔗糖溶液漂浮法常规方法常规方法PCR试剂试剂盒检测盒检测检测样品处理DNA提取PCR扩增产物检测实验结果实验结果M：DL2000 DNA Marker；1，12：阳性对照；2-11，13-22：阳性样品； 23：阴性对照结论：改良抗酸法阳性检出率4%-

20、25%，饱和蔗糖漂浮法阳性检出率4%-18%，PCR阳性检出率6%-31%。本试剂盒的检出率比常规方法高出2%-13%，显示本试剂盒具有特异性、敏感性等优点。 F Development and Application of Nested PCR Assay for Detection of Dairy Cattle-Derived Cyclospora sp. DNA samples of cattle-derived Cyclospora-like organisms, Giardia sp., Eimeria sp., Cryptosporidiumandersoni, ciliate,

21、 Trichuris sp., and swine-derived Eimeria sp., chicken-derived Eimeria sp. and Cryptosporidium baileyi DNA extracte PCR primers nested PCRPCRamplificationEvaluation of specificityEvaluation of sensitivityMATERIALS AND METHODSRESULTS G Combined PCR-oligonucleotide ligation assay for detection of dair

22、y cattle-derived Cyclospora sp Materials and methods cattle-derived Cyclospora sp, Giardia sp, Eimeria sp,Cryptosporidium andersoni,ciliate Trichuris sp.DNA extracte primers reporter probe selectionPCR procedureOLA procedure Evaluation of specificitysensitivity RESULTSFig. 4. Agarose gel electrophor

23、esis of different content of PCR products. Lane M, DL-2000 marker; lane 1, 50 ng; lane 2, 5 ng; lane3, 0.5 ng; lane 4, 0.05 ng.Fig.1. PCR amplicon of different genomic DNAFig. 3. Spectrophotometric absorbance (A 405 ) value of different content of PCR products.Fig. 2. Spectrophotometric absorbance (

24、A 405 ) value for different nested-PCR products. H 贝氏隐孢子虫 PCR 检测试剂盒的研制实验材料和方法实验材料和方法贝氏隐孢子虫GD 株卵囊卵囊纯化纯化DNADNA提取提取特异特异引物引物设计设计 反应反应条件条件优化优化试剂试剂盒组盒组装装特异特异性试性试验验敏感敏感性试性试验验实验结果实验结果稳定稳定性试性试验验重复重复性试性试验验保存保存期试期试验验图1 试剂盒的特异性试验结果图2 试剂盒敏感性试验结果图3 试剂盒稳定性试验结果XXXX年XXXX年图 2 饱和蔗糖溶液漂浮法处理的贝氏隐孢子虫卵囊( A 400; B 1000AB图 3 16份 C. baileyi 阳性样品的 PCR 扩增I 贝氏隐孢子虫 PCR 诊断试剂盒的应用XXXX年X