妥布霉素滴眼液对家兔细菌性角膜炎体内外抗菌作用

1、妥布霉素滴眼液对家兔细菌性角膜炎体内外抗菌作 用 【摘要】 目的：研究妥布霉素滴眼液的抗菌作用。方法：体外采用M-H肉汤稀 释法，妥布霉素滴眼液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓性链 球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌进行体外抑菌、杀菌试验。体内用角膜环钻 损伤兔眼角膜，感染大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓性链球菌 造成角膜炎动物模型。然后用妥布霉素滴眼液滴眼4次/d，每眼O.ImL,连续 给药 7d。 d8 处死家兔。以观察角膜病理切片，临床症状评分统计学 t 检验处理 及角膜分泌物细菌培养判断疗效。结果：体外试验表明妥布霉素滴眼液对上述 6种细菌最低杀菌浓度（MBC分别为0

2、.19，0.39，0.78，46.88，93.75 , 187.50卩g/mL。体内抗菌试验显示，家兔眼感染大肠埃希菌、金黄色葡萄球 菌、绿脓杆菌、化脓性链球菌感染后，妥布霉素滴眼液在治疗 3d 评分结果与未 治疗对照组比较均有显著差异，5d细菌培养转阴率大肠埃希菌、金黄色葡萄球 菌、绿脓杆菌均为 100%，化脓性链球菌 83%。角膜病理结果显示除化脓性链球 菌伤口愈合较慢，余 3 种菌伤口斑痕愈合良好。 结论：妥布霉素滴眼液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌敏感性较 强；所致家兔角膜炎治疗效果较好，化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球 菌对其敏感性较弱。 【关键词】 妥布霉素滴眼液；最低

3、抑菌浓度；最低杀菌浓度； 细菌性角膜 炎；疗效 Anti-bacterial effect of Tobramycin Eye Drops against rabbit keratitis in vitro and in vivo Yi Xiao1, Chen Li1, Qi-Bing Mei1 ， Feng Zhang1, Si-Yuan Zhou1, Ji-Xian Ma2 1Department of Pharmacology, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province , China; 2

4、Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province , China Abstract AIM: To investigate the anti-bacterial efficacy of Tobramycin Eye Drops against experimental keratitis on rabbits.METHODS: Tobramycin Eye Drops was stocked in 1g/L by

5、PBS, diluted in half concentration by M-H meat soup with addition of six different bacteria (1010CFU/L), which are Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, and Streptococcus pneumoniae, and subject to experimentation. Rabbit mode

6、l of keratitis was made by scratching parenchymal layer of cornea by corneal trephine with addition of 0.1 mL bacterial dilution (2X 1012CFU /L) per eyes, then the eyes were treated with Tobramycin Eye Drops q.i.d. in seven successive days, 0.1mL. At eighth day, the rabbits were executed, and the co

7、rnea was sliced for pathological examination. Corneal secretions were subject to bacterial culture one day before treatment and 1, 3, and 5 posttreatment. Evaluation scoring based on rabbit clinical manifestations was processed by t -test. RESULTS: In vitro test, the minimal bactericidal concentrati

8、on of Tobramycin Eye Drops were 0.19, 0.39, 0.78, 46.88, 93.75, 187.50 卩 g/mL for E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes, K. pneumoniae, and S. pneumoniae, respectively. In vivo test, evaluation scoring of Tobramycin Eye Drops at third day was significantly different compared with the contro

9、l group, while bacterial culture from corneal secretion were 100% negative for E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, and 83% negative for S. pyogenes at fifth day. Pathological examination results of the corneal sections demonstrated that the healing of keratitis was well enough for the first three bac

10、teria and slower for S. pyogenes. CONCLUSION: Tobramycin Eye Drops treats effectively for E. coli, S. aureus, and P. aeruginosa, but poorly for S. pyogenes, K. pneumoniae, and S. pneumoniae. KEYWORDS: Tobramycin Eye Drops; mi ni mal in hibitory concentration; minimal bactericidal concentration; bact

11、erial keratitis; efficacy 0 引言 近年来，随着抗生素及糖皮质激素在眼科的普遍应用，眼部微生物菌群 发生了变迁，由金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌感染眼部引起角膜炎是 目前眼科的常见疾患 1 ，2 。由于滥用抗生素和耐药菌株出现，临床抗感染治 疗失败已屡见不鲜，合理选用抗生素成为眼科医生不得不考虑的问题。妥布霉 素滴眼液是近几年用于临床的抗生素，临床常见菌对其敏感性到底如何？我们 选用南京恒生制药厂生产妥布霉素滴眼液，分别对金黄色葡萄球菌、绿脓杆 菌、大肠杆菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌 6 种菌进行体内外 抗菌试验，以便对临床合理使用抗生素提供依据。

12、1 材料和方法 1.1 材料 妥布霉素滴眼液 （ 商品名佳诺泰，含 3g/L 妥布霉素 ） ，南京 恒生制药厂生产。速眠新注射液 5mL/ 支，长春农牧大学兽医研究所研制，常温 避光保存。 Mueller-Hinton（M-H） 肉汤和营养琼脂培养基由北京奥博星生物技术 有限公司生产。大耳白家兔由第四军医大学动物中心提供，雌雄均有，体质量 22.5kg。实验前单笼常规饲养1wk,室温20C左右，自由饮水，检查双眼无 异常。大肠埃希菌 ATCC2592，2 金黄色葡萄球菌 ATCC2592，3 绿脓杆菌 ATCC2785，3 化脓性链球菌（临床株），肺炎克雷伯菌（临床株），肺炎链球菌 （临床株）

13、，由第四军医大学西京医院检验科提供。 1.2 方法 1.2.1体外试验 新鲜菌种接种M-H肉汤培养18h作原菌液，取0.1mL 测活菌数调整菌液1010CFU/L用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS将妥布霉素 滴眼液稀释成含妥布霉素浓度为1g/L ,过滤除菌4C保存备用，试验时先用 M- H肉汤倍比稀释，每管加1.0mL不同浓度的妥布霉素滴眼液，分别加入 1010CFU/L大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓性链球菌、肺炎克 雷伯菌、肺炎链球菌0.1mL;肺炎链球菌、化脓性链球菌每管各加兔血 1滴， 最终接种细菌量每管109CFU /L。同时设空白对照和阳性对照管（不加药）。 37C培

14、养1824h，测定最低抑菌浓度（MIC），继之选出未见细菌生长管中液 体0.1mL接种到琼脂培养基平板上（肺炎链球菌和化脓性链球菌接种血琼脂培 养板），进一步做最低杀菌浓度（MBC测定3。 1.2.2 体内试验 将接种于普通琼脂培养基平板上的大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌、绿脓杆菌和血琼脂培养板的化脓性链球菌用接种环刮下，生理盐 水分别配成2X1012 CFU/L （光电比浊仪测定浓度）。按方法4用角膜环钻致 家兔角膜损伤（双眼），家兔每眼感染细菌 0.1mL, 2d用无菌盐水棉签取眼睛 分泌物，放入4mL无菌生理盐水瓶中，用琼脂平板培养法对其液体做细菌培 养。同时进行炎症评分， 0级：眼明亮无

15、分泌物； 0.5 级：无分泌物覆盖，眼稍 有红肿； 1 级：分泌物覆盖小于 6mm； 2 级: 分泌物覆盖充满 6mm； 3 级：分泌物 覆盖大于6mm根据评分标准随机分组。治疗组（感染细菌 +妥布霉素滴眼 液），未治疗对照组（感染细菌 +滴生理盐水），各组 6 只家兔。正常对照组 （不造模、不感染细菌、滴生理盐水） 2只。治疗组滴妥布霉素滴眼液 0.8mL （ 2.4mg） /d （双眼），未治疗对照组和正常对照组滴生理盐水 0.8mL/d （双 眼），每眼0.1mL, 4次/d，连续点药7d。每隔24h双眼进行一次评分，连续 观察7d，评分结果作统计学t检验处理。并于给药前1d，给药后1，

16、3，5，7d 用无菌盐水棉签取眼分泌物作细菌培养，判断阴阳性结果。d8处死家兔，取角 膜放入40g/L甲醛中固定作病理切片，HE染色检查。 2 结果 2.1 体外试验 妥布霉素滴眼液最低杀菌浓度依次为大肠埃希菌金黄色 葡萄球菌 绿脓杆菌 化脓性链球菌 肺炎克雷伯菌 肺炎链球菌。最低抑菌浓度 （MIC）和 最低杀菌浓度（MBC见表1。 2.2 体内试验 四种菌感染兔眼 24h 后出现炎性症状，轻者结膜红肿眼 充血。重者全身状态欠佳伴结膜红肿充血，角膜水肿增厚，大量分泌物呈黄白 色，将上下眼睑粘住，双眼紧闭。绿脓杆菌感染的兔眼分泌物微显黄绿色。化 脓性链球菌感染炎症反应较重，持续 7d以上。评分标

17、准在1.53级。细菌培 养结果 ：给药前角膜分泌物 4 种细菌培养均为阳性，妥布霉素滴眼液治疗 5d 的角膜分泌物细菌培养转阴率大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均为 100%，化脓性链球菌 83%。家兔眼评分结果，与未治疗对照组比较，妥布霉素 滴眼液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓性链球菌感染组给药 后4,5d都有明显差异(P 0.01,表2)。病理切片,妥布霉素滴眼液治疗前3种 菌感染的角膜各层结构基本完整，伤口表面被复层鳞状上皮覆盖，伤口处有纤 维组织增生，伤口斑痕性愈合，未见炎细胞浸润；化脓性链球菌治疗组部分片 子可见角膜水肿，伤口未愈合并有少量炎细胞浸润；未治疗对照组感

18、染 4 种菌 后兔眼均显示角膜水肿，血管扩张充血，伤口未愈合并有溃疡，有大量炎细胞 浸润及坏死组织。正常对照组角膜完好无损。 3 讨论 妥布霉素属氨基糖甙类抗生素，抗菌机制是阻碍细菌蛋白质合成，改变 细胞膜通透性。抗菌谱与庆大霉素近似。对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性均 有良好作用。临床资料表明妥布霉素眼药水对细菌性结膜炎，细菌性角膜炎或 角膜溃疡、早期麦粒肿，眼睑炎等有明显效果，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆 菌、大肠杆菌仍为敏感药 5 ，抗绿脓杆菌作用更强，近半数绿脓杆菌对庆大霉 素耐药而对其敏感，而抗化脓性链球菌资料报道不多 7-9 。我们选择药物剂量 是根据产品推荐剂量，目的在于了解该滴眼液提

19、供的治疗剂量对常见几种细菌 的疗效，故未做多个剂量疗效的比较。首先用体外测定MIC和MBC选出对其 敏感性较强的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和较弱的化脓性链球菌 4 种细菌进行体内抗菌试验。采用角膜浅实质层损伤感染造成角膜炎动物模型， 再以妥布霉素滴眼液连续滴药 7d,经症状观察评分统计学t检验处理、细菌培 养、病理切片检查判定疗效。结果表明，感染 4种菌后，妥布霉素滴眼液治疗 34d后疗效明显。细菌培养5d转阴率大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆 菌均为 100%，化脓性链球菌 83%。病理切片检查可见对照组未经药物治疗靠自 身抗炎恢复较慢，7d伤口未愈合并有溃疡，有大量炎细胞浸润及坏死组织。而 给药组治疗 7d 可达到角膜结构基本完整，伤口处被上皮细胞覆盖，伤口瘢痕性 愈合的效果，疗效显著，说明角膜炎感染治疗越早疗效越好。在本实验中相比 较化脓性链球菌感染组虽然兔眼症状较重，恢复较慢，但统计学处理治疗效果 同样显著。分析原因： 1)机体受感染期，自身免疫机制参与抗炎作用的发挥有 关；2)妥布霉素滴眼液每日 2.4mg 治疗量足以达到杀死化脓性链球菌的剂量。 本实验进一步证明，用角膜环钻至家兔角膜损伤建立细菌性角膜炎的动物模型 方法可行。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、对妥布霉素滴眼液敏感 性较强；化脓性链球菌、肺炎链球菌