第二章第二节分子荧光和磷光分析法

1、*第二章第二章 分子发光分析法分子发光分析法一、一、 仪器与结构流程仪器与结构流程instrument and general process 二、二、 荧光分析法和应用荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、三、 磷光分析法及应用磷光分析法及应用phosphorescence analysis and application第二节第二节 分子荧光与磷光分析法分子荧光与磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis

2、 *一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由五个部分五个部分组成：激发光源、组成：激发光源、激发激发单色器、单色器、样品池、样品池、发射单色器和发射单色器和检测器。检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。高压汞灯是以汞蒸气放电发高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，主要有光的光源，主要有365、405、436nm 的三条谱线的三条谱线，尤以，尤以365nm谱线最强，谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源用它为激发光源 光源要求强光源要求强度大、使用度大、使用波长范围宽波

3、长范围宽*1.1.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 的乘积的乘积： If = Ia （1）式）式 根据吸收定律，根据吸收定律，I0入射光强度，入射光强度， It透射光强透射光强度，则度，则 Ia=I0- It （2）式）式 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：A= lg(I0/It)= bc It=I010-A=I010- bc Ia = I0(1-10- b c ) （3）式）式 If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) （4）式）式 将上式展开，得：将上式展

4、开，得： 二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用If = Kc当当I0一定时，得一定时，得! 332! 23232320f ).().(.IIbcbcbc浓度很低时（浓度很低时（A = bc 0.05时），时），得：得： If = 2.3 I0 b c I0It入射光入射光透过光透过光*定量关系的成立条件为：定量关系的成立条件为： bc小于小于0.05 ，此时，此时 与浓度与浓度无关，为定值；无关，为定值； 即这种线性关系即这种线性关系只有在极稀的溶液中才成立只有在极稀的溶液中才成立 对于较浓溶液，对于较浓溶液， 由于猝灭由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强现象和自吸收等原因，使荧光强度

5、与浓度不成线性关系。度与浓度不成线性关系。If = 2.3 I0 b c If = Kc问问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大倍数倍数; I0A= lg(I0/It)*（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；上求出浓度；1.

6、 确定确定 ex和和 em (激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱)；2. 确定适宜的条件确定适宜的条件: 试剂浓度、试剂浓度、pH、T、t 等；等；3. 以标准溶液做工作曲线；以标准溶液做工作曲线；4. 测未知样的荧光强度测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光根据工作曲线计算荧光物质的浓度物质的浓度. If = Kc*3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约与有机试剂形成配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采

7、用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定( (液氮温度液氮温度-196-196) )； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 如：如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发使其发生荧光猝灭生荧光猝灭,建立了测定微量建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法的催化荧光分析法. 如如:铀的测定铀的测定

8、:将将80gNaF压制成片压制成片,取含铀溶液滴在片上取含铀溶液滴在片上,在在1000烧成熔珠后测量烧成熔珠后测量.*(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 脂肪族有机化合物脂肪族有机化合物般需要与某些试剂反般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。应后才能进行荧光分析。 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸，可以直借用荧光法测定。基丙氨酸，可以直借用荧光法测定。 见表见表. 芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶、维生素等均可用荧光法

9、进行分析。、维生素等均可用荧光法进行分析。*磷光分析法基本原理磷光分析法基本原理一、磷光的产生和磷光强度一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。分子跃迁返回基态时所产生的辐射。二、与荧光比较，磷光的特点：二、与荧光比较，磷光的特点： (1)磷光辐射的波长比荧光长；磷光辐射的波长比荧光长； (2)磷光的发光速率慢，但具有较长的寿命；磷光的发光速率慢，但具有较长的寿命； (3)磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离子非常敏感 （4）发光效率受温度

10、影响大。）发光效率受温度影响大。 由于三重态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞由于三重态的寿命长，激发态分子与溶剂分子发生碰撞去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失。去激发的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失。 当磷光物质浓度很小时：当磷光物质浓度很小时： Ip = Kc*2重原子效应：重原子效应：1增加试样的刚性增加试样的刚性3.室温磷光室温磷光(1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅

11、胶等滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等 这种方法可减小质点间的碰撞几率这种方法可减小质点间的碰撞几率,以减小无辐射跃迁以减小无辐射跃迁.低低温荧光法就是基于这一原理的：在低温下（温荧光法就是基于这一原理的：在低温下（77K)，将试样的，将试样的乙醚或异戊醇溶液冷冻成透明玻璃状后测定。乙醚或异戊醇溶液冷冻成透明玻璃状后测定。 重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1T1的的系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。除了使用含有系间窜跃概率增大，有利于增大磷光

12、效率。除了使用含有重原子的溶剂外，还可采用重原子的溶剂外，还可采用Ag+盐、盐、Pb2+盐和盐和T1+盐等重金盐等重金属盐类。属盐类。三、为了获得较强的磷光，宜采用以下措施三、为了获得较强的磷光，宜采用以下措施:*(3)敏化磷光敏化磷光(2)胶束增稳：胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性 如：在表面活性剂十二烷基硫酸盐和重原子离子如：在表面活

13、性剂十二烷基硫酸盐和重原子离子T1+ (铊铊，音，音ta)和和Pb2+的存在下，室温可测定的存在下，室温可测定10-610-7mol的萘、芘的萘、芘和联苯，精密度达和联苯，精密度达6%。采用这种方法，可采用这种方法，可测定测定10-9mol/L的可卡因。的可卡因。 分析物本分析物本身年个并不发身年个并不发磷光磷光,而是引而是引发受体发磷光发受体发磷光.*四、磷光分析仪器四、磷光分析仪器 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷）通常借助于荧光

14、和磷光寿命的差别，在激发光被光寿命的差别，在激发光被旋转斩光片阻断时，荧光停旋转斩光片阻断时，荧光停止发射，而磷光则持续发射止发射，而磷光则持续发射。采用磷光镜的装置将荧光。采用磷光镜的装置将荧光隔开。隔开。（2 2）还可采用脉冲光源和）还可采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。室温测量时，不需要杜瓦瓶。 与荧光计区别：与荧光计区别：1.样品池样品池 2.斩光器斩光器*三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃和稠环芳烃和石油产品石油产品分析分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；杂环化合物（致癌物质）；如：芘、苯并芘、萘酚等，如：芘、苯并芘、萘酚等，见表见表2