《发酵工程制药》演示PPT

1、L/O/G/O 1 发酵工程制药发酵工程制药 L/O/G/O 2 第一节第一节 概述概述 3 又称微生物工程，是利用微生物制造工业原 料与工业产品并提供服务的技术。 现代发酵工程已形成完整的工业体系，包括 抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、有机溶剂、 多糖、酶制剂、单细胞蛋白、基因工程药物、核 酸类物质及其他生物活性物质等的生产。 发酵工程发酵工程 4 利用微生物技术，通过高度工程化的新型综 合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于 微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来 合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并 最终制剂成型来实现药物产品的生产。 发酵工程制药的定义发酵工程制药的定义

2、5 发酵工程的发酵工程的4 4个阶段个阶段 u第一阶段 1676年制成第一台显微镜 微生物的存在 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起 的 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒 精酶 6 u第二阶段 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于 厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳 酸和各种发酵食品。 u第三阶段 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素 迅速工业大规摸生产。 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、 核酸发酵成功。 7 u第四阶段 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 20世纪80

3、年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合 技术等高新技术应用阶段。 8 FERMENTATION Process Control Fermentation engineering 上游工程上游工程 UPSTREAM PROCESSES 下游工程下游工程 DOWNSTREAM PROCESSES 发酵工程组成发酵工程组成 从广义上讲，由三部分组成： 上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程 9 UPSTREAM PROCESSES - genetics, cell - inoculum development - media formulation - sterilization -

4、 inoculation FERMENTATION Process Control 上游工程上游工程 Fermentation engineering 10 DOWNSTREAM PROCESSES - product extraction, purification & assay - waste treatment -by product recovery FERMENTATION Process Control 下游工程下游工程 Fermentation engineering 11 1、微生物菌体的发酵 SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等） 生物防治制剂（如苏云金杆菌） 活性乳制剂 细

5、胞的生长与产物的积累成平行关系， 生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段。 微生物发酵类型微生物发酵类型 12 2、微生物酶发酵 各种酶制剂： 糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌 纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓 青霉素酰化酶：青霉素生产 需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种 选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。 13 3、微生物代谢产物发酵 初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物： 与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成 抗生素、生

6、物碱、毒素、色素、胞外多糖等 结构常较复杂对环境条件敏感 14 4、微生物转化发酵 利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物 的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱 氧或切断支链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、 结构位置特异性、立体特异性。 如：甾体转化如：甾体转化 可的松可的松 （Cortisone） 15 发酵技术的应用 产物：产物：微生物细胞，酶，活性物质，特殊化学品和食品添加剂。微生物细胞，酶，活性物质，特殊化学品和食品添加剂。 16 发酵工业简介发酵工业简介 u发酵食品发酵食品 u有机酸有机酸 u氨基酸氨基酸 u核酸类物质核酸类物质 u酶制剂酶制剂 u医药工

7、业（抗生素医药工业（抗生素） u饲料工业（单细胞蛋白）饲料工业（单细胞蛋白） u环境工程（废物处理）环境工程（废物处理） u其它其它 （冶金工业（冶金工业） Fermentation Industry uFermented Foods uOrganic Acids uAmino Acids uNucleotides uEnzymes uPharmaceutical (Antibiotics) uFeedstuff (eg. SCP) uEnvironmental Application (Waste Treatment) uOthers (eg. Metallurgical industry)

8、 17 药用发酵产品分类药用发酵产品分类 生物来源作用对象作用机制化学结构 细菌 真菌 放线菌 抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂 抑制细胞壁合成药 影响细胞膜功能药 干扰蛋白质合成药 抑制核酸合成药 抑制生物能量反应 药 抗生素 维生素 氨基酸 核苷酸 甾体激素 酶及酶抑制剂 18 发酵工程制药的特点发酵工程制药的特点 微生物菌种选育获得高产 发酵的理论产量存在约10%的变量 发酵过程常温常压，操作条件温和 纯种培养、无菌条件 生产过程是以生物体的自动调节方式进行的 分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段 投资少、见效快 19 发展趋势发展趋势 利用DNA重组技术和细

9、胞工程技术的发展、新的 工程菌和新型微生物的开发 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、 白介素促红细胞生成素等； 新型菌体制剂和疫苗。 红细胞生成素红细胞生成素 ( 治疗贫血治疗贫血) 生长激素生长激素 ( 促进生长促进生长) 胰岛素胰岛素 (治疗糖尿病治疗糖尿病) 干扰素干扰素 (抗病毒、抗肿瘤抗病毒、抗肿瘤) L/O/G/O 20 第二节第二节 发酵制药中的微生物发酵制药中的微生物 21 常见的制药用微生物常见的制药用微生物 细菌 放线菌 真菌 22 细菌之大肠杆菌属细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli) 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 基因工程的载体 23

10、 细菌之短杆菌属细菌之短杆菌属(Brevibacterium) 维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的 菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。 24 细菌之棒状杆菌属细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium) 生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌， 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542 25 细菌之芽孢杆菌属细菌之芽孢杆菌属(Bacillus) 生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12 用于甾体转化等 26 细菌之假单胞菌属细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas) 生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类 进行类固醇（甾体）转化 有些

11、菌株可利用烃类生产单细胞蛋白 27 细菌之乳酸杆菌属细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus) 生产抗癌类药物 28 放线菌放线菌 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌， 经济价值大。 29 放线菌之链霉菌属放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces ) 灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 产链霉素 金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 产金霉素 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 产红霉素 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus) 产土霉素 30 放线菌之诺卡氏菌属放线菌之诺卡氏菌属

12、(Norcadia) 生产利福霉素、蚊霉素等。 31 放线菌之小单胞菌属放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora) 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora) 产庆大霉素。 32 真菌之根霉属真菌之根霉属(Rhizopus) 生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。 33 真菌之曲霉属真菌之曲霉属(Aspergillus) 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素， 进行甾体转化。 34 真菌之青霉属真菌之青霉属(Penicillum) 产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄 糖酸、柠檬酸和抗坏血酸。 35 真

13、菌之头孢霉菌属真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium) 产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen) 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C 36 真菌之酵母菌属真菌之酵母菌属(Saccharomyces) u啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤 酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞 色素C、凝血质和辅酶A等。 u红酵母 (Rhodotorula)：-胡萝卜素 u棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素 37 真菌之其它真菌之其它 u牛肝菌属：含有人体必需的8种

14、氨基酸，还含有腺膘呤、 胆碱和腐胺等生物碱。 u灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其 中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、 香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量 元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。 38 发酵菌种的选育要求发酵菌种的选育要求 生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的 代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少。 操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分 离。 稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状 稳定、不易变异退化。 安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒 素。 39 诱变育种的理论依据是诱变育种的理论依据是DNA分子结

15、构的改变。分子结构的改变。 分为：分为： 菌种选育菌种选育 自然选育 诱变育种 杂交育种 原生质体融合 基因工程 40 从自然界中获得新菌种从自然界中获得新菌种 u土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端 环境等 u基本程序： 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型 菌株 41 诱变育种诱变育种 物理或化学方法诱发突变。 物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等 化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等 42 u自然选育自然选育：不经人工处理利用微生物的自然突变 进行育种的过程。 u诱变育种诱变育种：利用物理、化学等因素，诱发基因突 变，并从中筛选出具有某一优良性状的突变体。 u杂交育种杂交育种：借

16、助基因重组，使不同菌株的遗传物 质得以交换。 u原生质体融合育种原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗 传物质的交换。 u基因工程育种基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技 术含量高，应用面广。 43 基因突变及其机制基因突变及其机制 44 诱变育种操作步骤诱变育种操作步骤 45 质质 粒粒 育育 种种 46 转基因工程菌的构建转基因工程菌的构建 47 菌种保藏菌种保藏(Culture conservation) u目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力， 防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。 48 菌种保藏三要素菌种保藏三要素 典型菌种的优良纯种的休眠体； 创

17、造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、 避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。 49 菌种保藏的常用方法菌种保藏的常用方法 斜面低温保藏法 石蜡油封存法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法 50 方法名称主要特点适用范围保藏期 斜面低温保藏法传代培养，4保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月 石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温 或4保藏 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 1-2年 砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4保 藏 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的

18、微生物 1-10年 麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4 保藏 产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法 1年 甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱 基因工程菌1年/10年 冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机 各类微生物5-15年 液氮超低温保藏法保护剂，超低温（- 196），需超低温液氮 设备 各类微生物15年以上 宿主保藏法与培养基混合直接低温 保存 专性活细胞寄生微生物（如 病毒） 51 第三节第三节 发酵方式发酵方式 （一）分批培养（一）分批培养 （二）连续培养（二）连续培养 （三）其它培养方法（三）其它培养方法 52 （一）分批培养（一）

19、分批培养 1、分批培养的定义、分批培养的定义 2、分批培养的生长过程、分批培养的生长过程 3、分批培养过程中影响细胞生长的因素、分批培养过程中影响细胞生长的因素 53 分批培养是一种间分批培养是一种间 歇式的培养方法，歇式的培养方法， 在每一批次的培养在每一批次的培养 过程中，不再加入过程中，不再加入 其它营养物料。待其它营养物料。待 生物反应进行到一生物反应进行到一 定程度之后，将全定程度之后，将全 部培养液倒出、进部培养液倒出、进 行后道工序处理。行后道工序处理。 为了提高生物反应器在分批培养中的效率为了提高生物反应器在分批培养中的效率 通常采用多级分批培养的办法。通常采用多级分批培养的办

20、法。 即在小型生物反应器中接入少量种子即在小型生物反应器中接入少量种子 经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子 再转入到大型生物反应器中再转入到大型生物反应器中 分批培养的设备要求较少分批培养的设备要求较少 操作也较简单操作也较简单 工业微生物生产中经常采用工业微生物生产中经常采用 54 2、分批培养的生长过程、分批培养的生长过程 培养中的细胞经过培养中的细胞经过4个生长阶段：个生长阶段： （1）延迟期）延迟期 （2）指数生长期）指数生长期 （3）静止期）静止期 （4）衰亡期）衰亡期 55 1、延迟期、延迟期 （1）种龄越长，延迟期越长，）种龄越长

21、，延迟期越长， （2）接种量越少、延迟期越长。）接种量越少、延迟期越长。 4、衰亡期、衰亡期 营养物质消耗贻尽培养液中有营养物质消耗贻尽培养液中有 害物质积累太多导致培养液中害物质积累太多导致培养液中 的细胞开始死亡，称为衰亡期。的细胞开始死亡，称为衰亡期。 3、静止期、静止期 随着营养物质被逐渐消耗、细随着营养物质被逐渐消耗、细 胞的生长速率开始下降，最终胞的生长速率开始下降，最终 细胞浓度不再增加，称为静止细胞浓度不再增加，称为静止 期。期。 2、指数生长期、指数生长期 细胞的倍增时间指细胞浓度细胞的倍增时间指细胞浓度 增长一倍所需要的时间。微增长一倍所需要的时间。微 生物的倍增时间一般为

22、生物的倍增时间一般为0.5-1 小时。小时。 56 3、分批培养中影响细胞生长的因素、分批培养中影响细胞生长的因素 共有以下共有以下5种影响因素：种影响因素： （1）营养物质浓度）营养物质浓度 （2）温度）温度 （3）pH值值 （4）溶解氧浓度）溶解氧浓度 （5）产物）产物 57 （1）营养物质浓度）营养物质浓度 营养物质的限制性浓度营养物质的限制性浓度-当某一种营当某一种营 养物质的浓度下降到一定程度之后，就养物质的浓度下降到一定程度之后，就 会影响细菌的生长，此时的浓度就称为会影响细菌的生长，此时的浓度就称为 营养物质的限制性浓度。营养物质的限制性浓度。 营养物质的最大浓度营养物质的最大浓

23、度-当某一种营养当某一种营养 物质的浓度超过一定程度之后，也会对物质的浓度超过一定程度之后，也会对 细菌的生长产生抑制作用。细菌的生长产生抑制作用。 58 （2）温度）温度 当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低，当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低， 随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快，随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快， 当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性， 导致细菌生长速率的急速下降。导致细菌生长速率的急速下降。 微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的

24、最佳生产温度。 因此在具体的生产过程中，因此在具体的生产过程中， 培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域，培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域， 而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度，而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度， 以获得较多的产物以获得较多的产物 59 根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成：低温菌，根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成：低温菌， 中温菌，高温菌。中温菌，高温菌。 采用高温菌生产有许多优点：采用高温菌生产有许多优点： （1）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。 （2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长

25、速率较大。）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。 （3）不容易发生杂菌污染。）不容易发生杂菌污染。 （4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动 力消耗。力消耗。 发酵温度调控技术发酵温度调控技术 60 （3）pH值值 细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。 酵母菌、霉菌则喜酸性环境。酵母菌、霉菌则喜酸性环境。 乳酸菌、醋酸菌对于低乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好值环境有着很好 的耐受性。的耐受性。 61 （4）溶解氧浓度）溶解氧浓度 不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求不同的培养过程对于溶

26、解氧有着不同的要求 应该根据具体情况来加以控制。应该根据具体情况来加以控制。 空气过滤片空气过滤片 62 （5）代谢产物的抑制作用）代谢产物的抑制作用 细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这 种现象称作产物抑制作用。种现象称作产物抑制作用。 而代谢产物多数就是生物制物的原材料。而代谢产物多数就是生物制物的原材料。 因此，在实际生产过程中要设法定期收集因此，在实际生产过程中要设法定期收集 细胞的代谢产物细胞的代谢产物 63 （二）连续培养（二）连续培养 1、连续培养方法的优缺点、连续培养方法的优缺点 2、连续培养法的分类、连续培养法的分类 64 细菌连续培养的设

27、备简化示图细菌连续培养的设备简化示图 65 1、连续培养方法的优点、连续培养方法的优点 （1）细胞生长速率较高。）细胞生长速率较高。 （2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态 2、连续培养方法的缺点、连续培养方法的缺点 （1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增 加加 （2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基 因突变、因突变、 （3）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出 66 3、连续培养法的分类

28、、连续培养法的分类 可以分为以下可以分为以下3类：类： （1）单级连续培养）单级连续培养 （2）细胞回流式的单级连续培养）细胞回流式的单级连续培养 （3）多级连续培养）多级连续培养 67 （1）单级连续培养）单级连续培养 新鲜培养基的加入速率新鲜培养基的加入速率=培培 养之后的物料抽出速率。这养之后的物料抽出速率。这 种培养方法称为单级连续培种培养方法称为单级连续培 养法。养法。 在单级连续培养方法之中，在单级连续培养方法之中， 发酵液体积保持恒定，生物发酵液体积保持恒定，生物 反应器中各组分分布均匀。反应器中各组分分布均匀。 单级连续培养是一种最简单单级连续培养是一种最简单 的连续培养方法。

29、的连续培养方法。 68 （2）细胞回流式的单级连续培养）细胞回流式的单级连续培养 将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后 再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流 式的单级连续培养。式的单级连续培养。 细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物 反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。 69 （3）多级连续培养）多级连续培养 将几个生物反应器串联起来，第一个反将几个生物反应器串联起来，第一个反 应器的流出液作为第二个反应

30、器的流入液，应器的流出液作为第二个反应器的流入液， 第二个反应器的流出液又作为第三个反应第二个反应器的流出液又作为第三个反应 器的流入液，这种培养方式就称为多级连器的流入液，这种培养方式就称为多级连 续培养法。续培养法。 70 （三）其它培养方法（三）其它培养方法 1、补料分批培养、补料分批培养 2、透析培养、透析培养 3、萃取培养、萃取培养 4、闪蒸培养、闪蒸培养 5、离子交换培养、离子交换培养 71 1、补料分批培养、补料分批培养 补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的 一种操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应一种操作方法。是指在进

31、行分批培养中间，向生物反应 器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方 法。法。 （1）方法改良）方法改良 （2）补料分批培养的优点）补料分批培养的优点 （3）补料分批培养的缺点）补料分批培养的缺点 由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大，由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大， 到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出 72 （1）方法改良）方法改良 连续补料分批培养法连续补料分批培养法在进行补料分批培养时，在进行补料分批培养时， 如果所取出的培养液数量少于补进的物料数量，如果所取出的培养液数量

32、少于补进的物料数量， 反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为 连续补料分批培养。连续补料分批培养。 73 （2）补料分批培养的优点）补料分批培养的优点 （1）通过流加高浓度的营养物质，）通过流加高浓度的营养物质， 培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度 这对于细胞产物的生产十分有利这对于细胞产物的生产十分有利 （3）通过补料，能够解除某些营养物的低浓度限制效应）通过补料，能够解除某些营养物的低浓度限制效应 提高产物的合成效率。提高产物的合成效率。 （2）通过补料和放料的连续进行，）通过补料和放料的连续进行， 能

33、够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用能够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用 74 （3）补料分批培养的缺点）补料分批培养的缺点 （1）要考虑到生物反应器的供氧能力）要考虑到生物反应器的供氧能力 （2）要考虑培养过程中大量代谢产物积累后的）要考虑培养过程中大量代谢产物积累后的 细胞毒性细胞毒性 L/O/G/O 75 第四节第四节 发酵设备及消毒灭菌发酵设备及消毒灭菌 76 发酵的一般流程发酵的一般流程 种子扩大培养种子扩大培养 培养基配制培养基配制 空气除菌空气除菌 培养基灭菌培养基灭菌 发酵生产发酵生产 下游处理下游处理 发酵设备发酵设备 77 发酵设备发酵设备发酵罐发酵罐 u发酵罐的特点 轴

34、封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度 搅拌通风装置保证气液充分混合 具有足够的冷却面积 死角少，灭菌彻底 适宜的径高比（高与直径的比值为2.54） 78 u发酵罐的类型 搅拌釜反应器 鼓泡式反应器 气升式反应器 发酵设备发酵设备发酵罐发酵罐 79 发酵辅助设备发酵辅助设备 u无菌空气系统 u灭菌系统、管道、阀门 80 培养基及其灭菌培养基及其灭菌 u培养基（medium） u培养基的成分 碳源 氮源 无机盐 前体物 促进剂 抑制剂 81 u培养基灭菌 空罐灭菌 实罐灭菌 连续灭菌 L/O/G/O 82 第五节第五节 发酵工程制药的过程与控制发酵工程制药的过程与控制 83 发发 酵酵 过过 程程

35、 即微生物反应过程，指由微生物在生长繁即微生物反应过程，指由微生物在生长繁 殖过程中所引起的生化反应的过程。殖过程中所引起的生化反应的过程。 根据对氧的需要分：根据对氧的需要分：厌氧厌氧和和有氧发酵。有氧发酵。 根据培养基物理性状分：根据培养基物理性状分：液体液体和和固体发酵。固体发酵。 根据微生物生长特性分：根据微生物生长特性分：分批发酵分批发酵和和连续连续 发酵。发酵。 84 发酵的一般过程发酵的一般过程 空气空气 空气净化处理空气净化处理 保藏菌种保藏菌种 斜面活化斜面活化 扩大培养扩大培养 种子罐种子罐 主发酵主发酵 碳源、氮源、碳源、氮源、 无机盐等营养无机盐等营养 物质物质 灭菌灭

36、菌 产物分离纯化产物分离纯化 成品成品 85 发酵过程 86 菌种筛选菌种筛选 摇瓶试验摇瓶试验 发酵罐试验发酵罐试验 87 菌种菌种 选育选育 目的是改善菌种的特性，使能提高产量、目的是改善菌种的特性，使能提高产量、 改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及 综合利用等。综合利用等。 基本方法基本方法 自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的 选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技 术和体外重组术和体外重组DNA技术（基因工程）等。技术（基因工程）等。 88 从自然界分离从自然界分离

37、 采样采样 增殖培养增殖培养 纯种分离纯种分离 性能测定性能测定 地点地点 方法方法 目的目的 方法方法 方法方法方法方法 89 种子罐级数种子罐级数 指种子需逐级扩大培养的次数。一般根据种指种子需逐级扩大培养的次数。一般根据种 子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及 发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用 量少，故种子罐级数相应也少。如谷氨酸生产，量少，故种子罐级数相应也少。如谷氨酸生产， 种子接入种子罐后于种子接入种子罐后于320C培养培养7-10h，菌浓达到，菌浓达到 108-109个个/ml，即

38、可接入发酵罐作为种子，这称，即可接入发酵罐作为种子，这称 为为一级种子罐一级种子罐扩大培养，也称扩大培养，也称二级发酵二级发酵。 90 种子罐级数种子罐级数 对生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，对生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种， 种子接入一级种子罐种子接入一级种子罐270C培养培养40h后，再需后，再需 移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于 270C培养培养1024h移至发酵罐作为种子，称移至发酵罐作为种子，称 为为二级种子罐二级种子罐扩大培养，也称扩大培养，也称三级发酵三级发酵。一。一 般般50m3发酵罐都采用三级发酵。发酵罐都采用三级发酵。 91 发酵

39、过程 砂土孢子砂土孢子 冷冻干燥孢子冷冻干燥孢子 实验室种子制备阶段实验室种子制备阶段 （一级种子培养）（一级种子培养） 生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段 （二级发酵二级发酵 三级发酵三级发酵） 斜面孢子斜面孢子 摇瓶液体培养摇瓶液体培养 茄子瓶斜面培养茄子瓶斜面培养 固体培养基培养固体培养基培养 一级种子罐一级种子罐二级种子罐二级种子罐发酵罐发酵罐 种子扩大培养流程图 92 生理代谢生理代谢 菌种筛选菌种筛选 种子培养种子培养 发酵培养发酵培养 发酵 93 微生物发酵方式微生物发酵方式 l 分批发酵 l 补料分批发酵 l 半连续发酵 l 连续发酵 94 发酵过程中的中间分析项目发酵过

40、程中的中间分析项目 产物产量 pH 糖 氨基氮 菌丝形态 95 发酵过程的影响因素及控制发酵过程的影响因素及控制 菌体浓度 营养物质 温度 pH 溶氧 泡沫 染菌 发酵终点的判断 96 u菌体浓度 在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓 度成正比关系。特别是初级代谢产物。 菌体浓度过低，产物产率下降。 菌体浓度过高，产生其他影响。 措施：调节培养基中的营养物质的浓度。 97 u营养物质 碳源 氮源 磷酸盐：生长亚适量浓度 补料：半饥饿状态 98 u温度 考虑菌种及生长阶段 综合考虑其他培养条件 考虑菌种生长情况 发酵热 upH 补加酸或碱和补料的方式 99 u溶氧和CO2 溶氧异常下降 溶

41、氧异常上升 措施？ u泡沫 负面影响 措施 100 u染菌 发酵前期染菌 发酵后期染菌 u发酵终点的判断 提高产物的产量和经济效益 降低生产成本 101 第五节第五节 生产实例生产实例 u抗生素类抗生素类 u氨基酸类氨基酸类 u维生素类维生素类 u其它有机物与医药中间体其它有机物与医药中间体 102 一、抗生素的分类一、抗生素的分类 按进行生产的微生物母体分：按进行生产的微生物母体分： （1）细菌生产的抗生素）细菌生产的抗生素短杆菌肽，短杆菌肽短杆菌肽，短杆菌肽S、 杆菌肽、多粘菌素杆菌肽、多粘菌素B。 （2）霉菌生产的抗生素）霉菌生产的抗生素青霉素、灰黄霉素、甾青霉素、灰黄霉素、甾 酸菌素。

42、酸菌素。 （3）放线菌生产的抗生素）放线菌生产的抗生素链霉素、氯霉素、金链霉素、氯霉素、金 霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、利福霉素、卡霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、利福霉素、卡 那霉素、交沙霉素、麦迪加霉素。那霉素、交沙霉素、麦迪加霉素。 103 按化学结构分：按化学结构分： （1 1）-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素青霉素类、头孢菌素类。青霉素类、头孢菌素类。 （2 2）氨基糖苷类）氨基糖苷类链霉素、新霉素、卡那霉素、庆链霉素、新霉素、卡那霉素、庆 大霉素。大霉素。 （3 3）大环内酯类）大环内酯类红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉素、红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉素、 制霉菌素。制霉菌素。 （4 4

43、）四环素类）四环素类土霉素、金霉素、四环素。土霉素、金霉素、四环素。 （5 5）多肽类）多肽类杆菌肽、多粘菌素杆菌肽、多粘菌素B B 104 二、发酵法可以生产的种类二、发酵法可以生产的种类 （1）青霉素）青霉素 （2）头孢菌素）头孢菌素 （3）链霉素）链霉素 （4）卡那霉素）卡那霉素 （5）庆大霉素）庆大霉素 （6）红霉素）红霉素 （7）罗红霉素）罗红霉素 （8）麦迪霉素）麦迪霉素 （9）乙酰螺旋霉素）乙酰螺旋霉素 （10）四环素）四环素 （11）土霉素（氧四环素）土霉素（氧四环素） （12）金霉素（氯四环素）金霉素（氯四环素） （13）林可霉素）林可霉素 （14）多粘菌素）多粘菌素 （15

44、）杆菌肽）杆菌肽 105 三、生产和制造实例三、生产和制造实例 （1 1）青霉素（）青霉素（penicillinpenicillin） 青霉素发现者弗莱明青霉素发现者弗莱明 菌种菌种：黄青霉菌：黄青霉菌 原始材料原始材料：-氨基已二氨基已二 酸、半胱氨酸、缬氨酸。酸、半胱氨酸、缬氨酸。 发酵方法发酵方法：加前体物质：加前体物质 的深层发酵法的深层发酵法。 106 沙土管菌种沙土管菌种 转移到固体琼脂斜面培养基上，转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养培养5-6天，获得芽孢天，获得芽孢 芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养 进入移种瓶培养进入移种瓶培养 进种子罐，接种量为进种子罐，接种量为5%-10% 进