第3节 细胞培养的应用

1、第三节第三节细胞培养的应用细胞培养的应用一、植物细胞培养与次生代谢产物制备一、植物细胞培养与次生代谢产物制备植物细胞培养定义：植物细胞培养定义： 指在离体条件下，将愈伤组织等置于液体指在离体条件下，将愈伤组织等置于液体培养基中振荡培养，得到分散游离的悬浮细培养基中振荡培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。细胞群体的一种技术。（一）大规模植物细胞培养（一）大规模植物细胞培养1.1.单细胞制备方法单细胞制备方法 （1 1）机械法：）机械法： （2 2）酶解法：）酶解法： （3 3）愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤

2、组）愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织分散成单个细胞织分散成单个细胞（二）大规模植物细胞培养（二）大规模植物细胞培养 1.1.悬浮培养悬浮培养 将细胞接种于液体培养基中并保持良好的将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态分散状态. . 特点特点: :与培养液充分接触与培养液充分接触, ,促进营养吸收和促进营养吸收和气体供应气体供应; ; 细胞增殖快细胞增殖快, ,获得高浓度细胞获得高浓度细胞. .（二）大规模植物细胞培养（二）大规模植物细胞培养2.2.固定化培养固定化培养 将游离细胞包埋在支持物内部或表面进行将游离细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一种方法培养的一种方法. . 特点特点:

3、 :维持细胞良好的稳定性。维持细胞良好的稳定性。 方法：方法： 吸附固定法、离子吸附固定法、离子/ /共价交联法、共价结共价交联法、共价结合法、包埋法、微囊化等。合法、包埋法、微囊化等。3.3.大规模植物细胞的生物反应器大规模植物细胞的生物反应器光生物反应器组合式反应器非机械搅拌反应器机械搅拌反应器悬浮培养反应器膜反应器流化床反应器填充床反应器固定化细胞培养反应器（1-11-1）机械搅拌式反应器）机械搅拌式反应器优点：优点：混合性能好混合性能好传氧效率高传氧效率高操作弹性大操作弹性大可用于细胞高密度可用于细胞高密度培养；培养；缺点：缺点：剪切力大。剪切力大。（1-11-1）机械搅拌式反应器）机

4、械搅拌式反应器搅拌式反应器结构示意图搅拌式反应器结构示意图11搅拌器；搅拌器；22罐体；罐体；33夹套；夹套；44搅拌轴；搅拌轴；55压出管；压出管；66支座；支座；77人孔；人孔；88轴封；轴封；99传动装置传动装置典型的搅拌结构典型的搅拌结构（1-21-2）非机械搅拌式反应器）非机械搅拌式反应器 非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单。其主要类型有构简单。其主要类型有鼓泡式反应器鼓泡式反应器、气升式气升式反应器反应器等气体搅拌式反应器等气体搅拌式反应器 Air inletGas outletCulture mediumSieve plate气升式反应

5、器气升式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器11分布格板；分布格板；22夹套；夹套；33气体分布器；气体分布器；44塔体；塔体；55挡板；挡板；66塔外换热器；塔外换热器；77液体捕集器；液体捕集器；88扩大段扩大段（1-3）组合式反应器）组合式反应器 利用利用“ 优势互补优势互补”原则，将两种反应器原则，将两种反应器结合起来研究出组合结合起来研究出组合式反应器。带有低速式反应器。带有低速搅拌的气升式发酵罐搅拌的气升式发酵罐可弥补低气速时混合可弥补低气速时混合性差的弱点。性差的弱点。（1-4） 光生物反应器光生物反应器（1-5）转鼓式生物反应器）转鼓式生物反应器（2-1）固定化培养的生物反应器）固定

6、化培养的生物反应器流化床流化床两类两类: :液液- -固两相固两相 气气- -液液- -固三相固三相优点：优点：细胞与流体能细胞与流体能充分混合、接触。充分混合、接触。不足：不足：细胞与流体碰细胞与流体碰 撞易伤细胞撞易伤细胞（2-22-2）固定化培养生物反应器）固定化培养生物反应器固定化床固定化床 固定床生物固定床生物反应器两类反应器两类: : 填充床反应器填充床反应器 涓流床反应器涓流床反应器（三）（三） 植物细胞培养制备代谢产物植物细胞培养制备代谢产物 细胞代谢产物包括初级代谢产物与次级代细胞代谢产物包括初级代谢产物与次级代谢产物谢产物. .1.1.初级代谢产物：初级代谢产物： 通过初级

7、代谢产生的维持细胞生命活动必通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质。如：需的物质。如：AAAA、核苷酸、多糖、维生素等。、核苷酸、多糖、维生素等。2.2.次级代谢产物：次级代谢产物： 通过次级代谢合成的分子结构较复杂的小通过次级代谢合成的分子结构较复杂的小分子化合物。如：抗生素、生物碱、毒素等。分子化合物。如：抗生素、生物碱、毒素等。（三）（三） 植物细胞培养制备代谢产物植物细胞培养制备代谢产物 次级代谢产物的利用：次级代谢产物的利用： （1 1）药用：如紫杉醇、生物碱类、萜类等）药用：如紫杉醇、生物碱类、萜类等 （2 2）食品、食品添加剂：如胡萝卜素、甜）食品、食品添加剂：如胡萝卜素、

8、甜菊苷、辣椒素等。菊苷、辣椒素等。 （3 3）杀虫剂、杀菌剂：如万寿菊细胞培养）杀虫剂、杀菌剂：如万寿菊细胞培养产物农药噻吩烷、葫芦巴培养产物蓝鱼藤酮等。产物农药噻吩烷、葫芦巴培养产物蓝鱼藤酮等。 （4 4）饲料、精细化工产品：）饲料、精细化工产品：（四）生产次生代谢产物的细胞株要求（四）生产次生代谢产物的细胞株要求 分散好分散好, ,适合于大规模悬浮培养适合于大规模悬浮培养; ; 均一性好均一性好, ,大小与生理状况一致大小与生理状况一致; ; 生长快生长快; ; 目标产物含量高目标产物含量高; ; 细胞遗传性能稳定细胞遗传性能稳定. .二、动物细胞培养与表达制备药用蛋白二、动物细胞培养与表

9、达制备药用蛋白 1962年开始，用于生物医学研究，生产酶年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等。制剂，生长因子，疫苗，单抗等。 如：纤溶酶原激活剂（如：纤溶酶原激活剂（t-PA）、神经生长）、神经生长因子（因子（NGF）、）、 乙肝疫苗（乙肝疫苗（HbsAg）、干扰素）、干扰素（IFN）、白介素（）、白介素（IL）等）等（一）病毒疫苗生产：（一）病毒疫苗生产：VeroVero细胞培养细胞培养DMEMDMEM培养基培养基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分锥形瓶逐级锥形瓶逐级放大培养放大培养加碱（碳酸加碱（碳酸氢钠）氢钠）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培养液灌注培养液微载体微

10、载体5L5L种子罐培种子罐培养养培养液培养液50L50L生生物物反反应应器器接种狂犬接种狂犬病毒病毒出液口出液口收获病毒收获病毒（二）基因工程药物生产（二）基因工程药物生产 重组干扰素（重组干扰素（IFNIFN）定义：定义： 由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。 种类：种类： IFN-IFN-白细胞产生；白细胞产生； IFN-IFN-成纤维细胞产生；成纤维细胞产生； IFN-IFN-致敏致敏T T细胞产生细胞产生干扰素作用机制干扰素作用机制干扰素的生产：干扰素的生产： 传统方法：传统

11、方法：从人血液中的白细胞内提取每从人血液中的白细胞内提取每300L300L血液才能提取血液才能提取1mg 1mg 基因工程：基因工程：将干扰素基因转移到大肠杆菌中。将干扰素基因转移到大肠杆菌中。每千克培养液可提取每千克培养液可提取20-40 mg20-40 mg。 我国的基因工程重组我国的基因工程重组IFNIFN有有: : 1b( 1b(如赛若金如赛若金: :科兴科兴 军事预防科学院等军事预防科学院等) ) 2b( 2b(如安达芬如安达芬: :长春生物等长春生物等) )细胞细胞IFNIFN诱生剂诱生剂产生特异性因子，使阻抑蛋白灭活产生特异性因子，使阻抑蛋白灭活干扰素基因解除抑制干扰素基因解除抑

12、制IFNIFN基因活化产生干扰素基因活化产生干扰素体内干扰素产生机制体内干扰素产生机制: :重组干扰素生产机制重组干扰素生产机制干扰素生产车间干扰素生产车间实例实例：（1 1）过程）过程1 1表示可以通表示可以通过人工合成方法获得干过人工合成方法获得干扰素基因。其主要步骤扰素基因。其主要步骤可概括为：由干扰素中可概括为：由干扰素中_顺序推导出顺序推导出_顺序，再进顺序，再进一步推导出一步推导出_顺序。人工合成的干扰顺序。人工合成的干扰素基因在实验室可通过素基因在实验室可通过_技术进行人工扩增。技术进行人工扩增。氨基酸氨基酸mRNA的碱基的碱基基因的碱基基因的碱基PCR实例实例：（2 2）过程）

13、过程2 2需要的工具酶有需要的工具酶有_。（3 3）欲将大肠杆菌）欲将大肠杆菌b b筛选出筛选出来，应利用基因表达载体来，应利用基因表达载体（重组（重组DNADNA分子）上的分子）上的_。（4 4）干扰素不能在高温环境）干扰素不能在高温环境中保存，其原因是中保存，其原因是_。限制性内切酶和限制性内切酶和DNA连接酶连接酶 标记基因标记基因干扰素是蛋白质，高温下会变性干扰素是蛋白质，高温下会变性（三）单克隆抗体生产（三）单克隆抗体生产 1.1.何谓单克隆抗体？何谓单克隆抗体？ 通过通过B B细胞杂交瘤技术细胞杂交瘤技术, , 获得特异性针对获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性某一

14、种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体的抗体. . 单克隆抗体技术的核心是用单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的与经特定抗源免疫刺激的B淋巴淋巴细胞细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得融合得到到杂交瘤细胞杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为克隆抗体技术又称为杂交瘤技术杂交瘤技术(hybr

15、idoma technology ）。）。2.2.杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理2.2.杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理实例：实例：下图为某同学根据杂交下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。请据图回答实验方案。请据图回答： （1）该方案能达到）该方案能达到预期效果吗？预期效果吗？ 。原因是原因是没有将抗原注入没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产小鼠体内，无法获得产生单一抗体的效应生单一抗体的效应B细胞细胞 不能不能（2 2）图中）图中为为 过程，常用过程，常用 作作为诱导剂。该细胞继承了为诱导剂。该细胞继承了 ，因此，因此不仅能不仅能 ，还有，还有 本领。本领。（3 3）图中）图中进行细胞培养，进行细胞培养，目的是目的是 。 细胞融合和筛选细胞融合和筛选灭活的病毒灭活的病毒双亲细胞的遗传物质双亲细胞的遗传物质大量繁殖大量繁殖产生特异性抗体产生特异性抗体在体外条件下大量增殖在体外条件下大量增殖 （4 4）在制备破伤风杆菌抗）在制备破伤风杆菌抗体的过程中，进行了两次体的过程中，进行了两次筛