大豆制品脲酶活性测定

1、大豆制品中尿素酶（脲酶）活性的测定晁洪雨2016.4.8 一、测定的原因： 生大豆含有多种能被热破坏的抗营养因子（如抗胰蛋白酶）。大豆中脲酶的含量与抗胰蛋白酶成正相关，且能很快、很经济地予以测定。所以，测定脲酶的活性（UA），就可以预测大豆饼粕的加工程度是否适当及营养品质的优劣。二、影响大豆制品脲酶活性的因素： 大豆加热过程中的温度； 大豆原料最初的水分含量； 大豆粒度的大小； 加热时所用压力的大小； 大豆加热时间的长短。 高温、高湿、高压，粒度小，时间长脲酶活性低。但是，加工过度，一些氨基酸会被破坏。所以脲酶活性过高（豆制品过生）或过低（豆制品过熟）都表明豆制品质量较差。三、测定原理： 脲酶

2、活性测定实际上是在一定条件下(pH=7.0，T=30)，测定每克试样、每分钟分解尿素所产生的氨的量。 脲酶 NH2CONH22NH3+CO2 四、测定方法：（一）定性法：1、酚红法（1）原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0，T=30时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。（2）仪器和试剂： 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 分析天平：感量0.01g 25ml纳式比色管 恒温水浴锅 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液 结晶尿素：分析纯（3）方法： 粉碎称取0.050.001

3、g放入试管加入尿素0.2g、指示剂5滴加蒸馏水25mL摇动10s立即置于300.5水浴锅计时观察溶液变红时间5 min后取出试管，摇匀继续观察 空白试验：不加尿素，其他同上。 品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。 0-1min变红，活性非常强（1.0）； 1-2min变红，活性大概0.5-1.0； 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。（4）注意事项： 1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定； 2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差； 3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。 2、尿素酚红法（1）原理：酚

4、红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。 （2）仪器和试剂：l表面皿；l0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；l1.0N硫酸溶液：移取14.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；l 尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L； 此时溶液应具有明亮的琥珀色；

5、（过 段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色） （3）方法： 将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。 如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。（4）注意事项： 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不可太细，否则不容易观察； 2.样品一定要铺平，容易观察； 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内用完； 4.此方法容易受颗粒度影响。 （二）定量法 1、 pH增值法（1）原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的pH值升高，通过测定样品溶液的p

6、H值和空白的pH值之差来计算脲酶的活性。脲酶活性定义为：在30和pH=7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后所释放的氨态氮的毫升数。（2）仪器与器皿v酸度计（pH计）：具有玻璃电极、甘汞电极v恒温水浴：须能保持温度300.5v试管：20150mm并配有橡皮塞（50mL）（3）试剂 磷酸缓冲液0.05mol/L：称取3.403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。再称取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸馏水中，合并两者并配成1000mL，用强酸或强碱调节pH=7.0。 尿素缓冲液：称取15g尿素，溶于500mL磷酸缓冲液中，调节pH=7.0。 样品粉碎：至少60%通过400微米试验筛。（

7、4）操作步骤 准确称取0.4000.00lg样品2份，分别置于2支试管中。一支试管加入20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一支加入20mL尿素缓冲液（B管）。 盖塞混匀，在30恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇匀一次。取出立即在流水中冷却，5min内测定溶液pH值。 （5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管) 2、滴定法 （1）原理： 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30保持30min后，尿素酶催化尿素水解产生氨，用过量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。 （2）脲酶活性定义 在30和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后，所释放的氨态氮的

8、毫克数。 (3)仪器与设备v样品筛：孔径200mv酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置v恒温水浴：可控温300.5v试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子v精密计时器v粉碎机：粉碎时应不生强热（如球磨机）v分析天平：感量0.1mgv移液管：10m1 （4）试剂 u尿素：分折纯。u磷酸氢二钠：分析纯。u磷酸二氢钾：分析纯。u尿素缓冲液（pH 6.9至7.0）：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶于此缓冲溶液中，u 盐酸：分析纯，0.1mol/L溶液u氢氧化钠：分析纯，0.1mol/L标推溶液，按GB 601-77标准溶液制备方法的规定配制。 （5）操作方法 称取0.2g试样转入试管加入10mL尿素缓冲液立即盖塞、剧烈摇动马上置于300.5恒温水浴准确计时30min加入10mL0.1mol/L盐酸迅速冷却到20内容物全都转入烧杯立即用氢氧化钠标淮溶液滴定到pH4.70。 空白试管加入10mL尿素缓冲液加入10mL0.1mol/L盐酸称取0.2g试样加入试管立即盖塞、剧烈摇动马上置于300.5恒温水浴准确计时30min迅速冷却到20内容物全都转入烧杯立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4.70。 （6）计算结果 UA=14C(V0-V)/(30m)C氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）