血清球蛋白的提纯

1、实验实验4 4血清血清- -球蛋白的提纯球蛋白的提纯purification of serum -globulin 遵义医学院生物化学教研室遵义医学院生物化学教研室 朱朱 欣欣 婷婷实验实验思路思路蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的分离方法有哪些？蛋白质的分离方法有哪些？本次实验利用了哪个性质？本次实验利用了哪个性质？ 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质的基本原理及操作；的基本原理及操作；2.2.掌握离心机的操作；掌握离心机的操作；3

2、.3.熟悉蛋白质定性检测的方法；熟悉蛋白质定性检测的方法；分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷定义：定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。使从溶液中沉淀析出的现象。 原理原理: : 破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷

3、层中性盐：中性盐：(nh(nh4 4) )2 2soso4 4、nana2 2soso4 4、naclnacl等。等。优点：优点：蛋白质不变性，常用。蛋白质不变性，常用。 （一）盐（一）盐 析析 法法 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷【实验原理【实验原理】 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷（二）层析法（二）层析法待分离物质待分离物质( (流动相流动相) )经过一个固态物经过一个固态物质质( (固定相固定相) )时，根据溶液中待分离物质颗时，根据溶液中待分离物质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离蛋白组分在两相中反复分配，并以不同流蛋白组

4、分在两相中反复分配，并以不同流速流经固定相实现分离。速流经固定相实现分离。凝胶层析法凝胶层析法 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷定义：定义：（三）透（三）透 析析 法法 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷临床应用：临床应用：血液透析血液透析 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷（四）离心技术（四）离心技术 离心技术离心技术 是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心是将含有微小颗粒的悬浮液置于离心转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗转子中，利用转子绕轴旋转产生的离心力将微小颗粒按密度或质量的差异将其分离的方法。粒按密度或质量的差异将其分离的方法。沉降速度沉降速度(v) 指

5、在强大的离心力作用下，单位时间内指在强大的离心力作用下，单位时间内物质颗粒沿半径方向运动的距离。物质颗粒沿半径方向运动的距离。 v=6.09210-4d2（m）n2r/m d 颗粒直径颗粒直径 颗粒的密度颗粒的密度m 介质的密度介质的密度m 介质粘度介质粘度 r 旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离）旋转半径（物质质点所处位置与旋转中心的距离） n 转子转速转子转速 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 离心操作要领离心操作要领1 1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管载液体时

6、要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形免离心管变形。 2 2、精确地平衡离心管及其内容物。、精确地平衡离心管及其内容物。3 3、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置4 4、启动离心时离心速度由慢到快，当到达离心时间时，、启动离心时离心速度由慢到快，当到达离心时间时， 开启减速或速度调节旋钮减速。开启减速或速度调节旋钮减速。 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷检测蛋白质检测蛋白质 双二缩脲

7、试剂：溶液显紫红色双二缩脲试剂：溶液显紫红色 2020磺柳酸磺柳酸 ：有白色沉淀产生：有白色沉淀产生检测检测nhnh4 4+ + 纳氏试剂：黄色或棕色纳氏试剂：黄色或棕色五、检测蛋白质、五、检测蛋白质、 nhnh4 4+ +的方法的方法1. 1. 盐盐 析析2.2. 透透 析析3.3. 脱脱 盐盐4. 4. 检检 测测 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.盐析盐析取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清2ml加入加入2ml pbs摇匀摇匀逐滴加入逐滴加入ph7.2饱和饱和(nh4)2so4 2ml,摇匀摇匀上清液（主要含清蛋白）上清液（

8、主要含清蛋白）倾入试管中倾入试管中静止静止10分钟，再离心（分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟沉淀用沉淀用1ml pbs搅拌溶解搅拌溶解逐滴加饱和逐滴加饱和(nh4)2so4 0.5ml,摇匀摇匀静止静止10分钟，再离心分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯化的化的球蛋白球蛋白透透 析析脱脱 盐盐 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷2.2.透透 析析清蛋白清蛋白 换换 水水透析袋刚放入水中时透析袋刚放入水中时,立即取袋外液体检查有无立即取袋外液体检查有无nh4；每隔每隔4分钟检查一

9、次，分钟检查一次，共共3次，比较次，比较nh4透出的透出的情况。情况。 约约0.5小时，检查袋外液体的小时，检查袋外液体的nh4；取袋外液取袋外液2滴，置于小试管中，滴，置于小试管中，然后滴加然后滴加20磺柳磺柳 酸酸12滴，观滴，观察有无沉淀产生。察有无沉淀产生。 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷3.3.脱盐脱盐 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上样上样球蛋白，球蛋白，pbs 10pbs 10滴溶解滴溶解 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶g25，柱，柱 高高3/42/3柱长柱长流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 加入洗脱剂加入洗脱剂pbs 10ml 收集收集20滴换一滴

10、换一支试管支试管. .层析后洗脱液检测层析后洗脱液检测n每组两块比色板每组两块比色板, ,洗净备用。洗净备用。n一块在各孔滴加纳氏试剂（检测一块在各孔滴加纳氏试剂（检测nhnh4 4+ +）, ,另一块滴加双二缩脲另一块滴加双二缩脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。n不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒n用用“-”-”表示无现象，用表示无现象，用“+”, “+”, “+”+”, “+”, “+”等表示颜等表示颜色深浅色深浅 回收凝胶回收凝胶 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷表表1. 层析后洗脱液

11、的显色结果层析后洗脱液的显色结果表表2. 透析后的袋外溶液显色结果透析后的袋外溶液显色结果试管编号试管编号12345678910缩二脲试剂缩二脲试剂检测后现象检测后现象纳氏试剂检纳氏试剂检测后现象测后现象检测次数检测次数123456试试 剂剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂20%磺柳酸磺柳酸现现 象象棕色（棕色（+） 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷. .使用离心机的操作注意事项。使用离心机的操作注意事项。. .装柱时检查是否有尼龙布，是否漏水。装柱时检查是否有尼龙布，是否漏水。. .装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整。装柱后凝胶

12、均一无断层，无气泡，柱床面平整。. .柱床面保持有缓冲液。柱床面保持有缓冲液。. .层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。. .每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染品交叉污染思思 考考 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1 1为何硫酸铵能沉淀蛋白质为何硫酸铵能沉淀蛋白质? ?第一次盐析时硫酸铵的饱和度第一次盐析时硫酸铵的饱和度是多少是多少? ?沉淀的是何种蛋白质，使沉淀溶解再次盐析的目的是沉淀的是何种蛋白质，使沉淀溶解再次盐析的目的是什么什么? ?2 2根据凝胶过滤原理解释根据凝胶过滤原理解释sephadexsephadex g g2525脱盐的实验结果。脱盐的实验结果。3 3用硫酸铵分段沉淀蛋白质时，透析袋外液体会出现蛋白质用硫酸铵分段沉淀蛋白质时，透析袋外液体会出现蛋白质吗吗? ?你能否做一个小实验加以证实，并说明实验原理。你能否做一个小实验加以证实，并说明实验原理。4. 4. 请用已学习的方法来证明本次实验每次离心后所得的样品请用已学习的方法来证明本次实验每次离心后所得的样品是血清蛋白中的哪种蛋白质？是血清蛋白中