血清学反应试验课件

1、血清学反应试验1 血清学试验血清学试验 血清学反应试验2 血清学试验 血清学鉴定： 用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原 血清学诊断： 用已知抗原检测血清中的特异性抗体 血清学反应试验3 抗原（antigen） 是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏 淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在 体内或体外发生特异性反应的物质（反应原体内或体外发生特异性反应的物质（反应原 性）。性）。 血清学反应试验4 （一）抗原的性质（一）抗原的性质 1.1.异物性异物性 异种间的物质异种间的物质 同种异体间的物质同种异体间的物质 眼睛

2、水晶体蛋白质、精眼睛水晶体蛋白质、精 细胞及甲状腺球蛋白等细胞及甲状腺球蛋白等 自体内隔绝物质：自体内隔绝物质： 抗原的性质 血清学反应试验5 抗原的性质 3.3.立体化学结构：一般分子结构和空间构象愈复杂立体化学结构：一般分子结构和空间构象愈复杂 的物质，免疫原性愈强。的物质，免疫原性愈强。 4.4.抗原决定族抗原决定族antigenic determinant(antigenic determinant(抗原分子表抗原分子表 面上的具有一定化学组成和结构的特殊化学基团面上的具有一定化学组成和结构的特殊化学基团) ) 决定其特异性决定其特异性 2.2.分子量足够大：一般分子量足够大：一般10

3、104 4道尔顿道尔顿 血清学反应试验6 抗原决定族 血清学反应试验7 人工抗原人工抗原 天然抗原天然抗原 合成抗原合成抗原 异种抗原异种抗原 同种异体抗原同种异体抗原 自身抗原自身抗原 核酸抗原核酸抗原 蛋白质抗原蛋白质抗原 脂抗原脂抗原 多糖抗原多糖抗原 抗原种类抗原种类 抗原的种类抗原的种类 半抗原（只有反应原性而无免疫原性）半抗原（只有反应原性而无免疫原性） 完全抗原完全抗原 血清学反应试验8 微生物抗原成分微生物抗原成分-细菌抗原成分细菌抗原成分 菌体抗原菌体抗原: :革兰氏阴性菌的菌体抗原称革兰氏阴性菌的菌体抗原称O O抗原抗原-脂脂 多糖蛋白质的复合物多糖蛋白质的复合物 微生物抗

4、原微生物抗原 鞭毛抗原称为鞭毛抗原称为H H抗原抗原 表面抗原表面抗原: :不同细菌的表抗原名称不同不同细菌的表抗原名称不同. .大肠杆菌的大肠杆菌的 表面抗原称为封套抗原或表面抗原称为封套抗原或K K抗原抗原, ,肺炎双球菌的叫荚膜肺炎双球菌的叫荚膜 抗原抗原, ,伤寒沙门氏菌的表面抗原称为伤寒沙门氏菌的表面抗原称为ViVi抗原抗原 血清学反应试验9 细菌抗原细菌抗原 细菌的各种抗原 血清学反应试验10 微生物抗原微生物抗原 颗粒抗原颗粒抗原 组分抗原组分抗原 可溶性抗原可溶性抗原 微生物抗原成分微生物抗原成分-病毒抗原成分病毒抗原成分 血清学反应试验11 抗体 是由抗原刺激人体或动物体的是

5、由抗原刺激人体或动物体的B B细胞细胞, ,由由B B细胞转化成细胞转化成 浆 细 胞 所 产 生 的 具 有 特 异 性 的 免 疫 球 蛋 白浆 细 胞 所 产 生 的 具 有 特 异 性 的 免 疫 球 蛋 白 (immunoglobulin,(immunoglobulin,缩写为缩写为Ig)Ig) 抗体抗体(antigen) 血清学反应试验12 抗体种类 IgIg：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量 的的80%80%）和组织液中。）和组织液中。 抗体的结构和种类抗体的结构和种类 IgAIgA：二体：二体 IgDIgD： IgEIgE： IgMIgM：五体

6、：五体 血清学反应试验13 IgG结构结构 血清学反应试验14 IgA结构结构 IgIg：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的：存在于血清（占血清免疫球蛋白总量的13%13%） 和外分泌液中和外分泌液中 血清学反应试验15 IgM 等结构等结构 IgIg：血液中：血液中 IgIg：血清中，：血清中，1%1% IgIg：血清中，：血清中，0.002%0.002% 血清学反应试验16 抗体的产生部位 淋巴器官淋巴器官 一级淋巴器官一级淋巴器官 二级淋巴器官二级淋巴器官 胸腺胸腺 骨髓骨髓 ( (鸟鸟) )法氏囊法氏囊 淋巴结（约淋巴结（约500-600个）个） 脾脏脾脏 血清学反应试验17 抗体在人

7、体中产生部位抗体在人体中产生部位 thymus Bone marrow spleen Lymph node 抗体的存在部抗体的存在部 位位:血清、乳汁、血清、乳汁、 体液体液 血清学反应试验18 抗抗 体体 作作 用用 血清学反应试验19 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 （ADCC） 血清学反应试验20 抗原抗体反应 抗原抗体反应（抗原抗体反应（antigen-antibodyreactionantigen-antibodyreaction）是指抗原与相应）是指抗原与相应 抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivoinvivo），）

8、， 也可发生于体外也可发生于体外(invitro)(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、 中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类 型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同， 可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各 种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体 的检测中多采用血清

9、作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血 清反应（清反应（erologicreactionerologicreaction）。）。 血清学反应试验21 抗原抗体反应条件抗原抗体反应条件 抗原抗体抗原抗体反应条件反应条件 抗原抗原 抗体抗体 3. 3. 环境因素：环境因素： （1 1）电介质：）电介质：0.85%NaCI0.85%NaCI； （2 2）温度：）温度：3737或或5656 （3 3）pHpH值：值：7.07.0 （4 4）振荡：）振荡：适当的机械振荡适当的机械振荡 （5 5）反应时间反应时间 血清学反应试验22 抗原抗体反应一般规律

10、 特异性和交叉性特异性和交叉性 若两种抗原之间含有若两种抗原之间含有部分共同抗原部分共同抗原时，则发生交叉反时，则发生交叉反 应。应。亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高 。 反应的可逆性反应的可逆性 抗原与抗体的结合为抗原与抗体的结合为分子表面的结合，分子表面的结合，结合的适宜温结合的适宜温 度为度为040、pH在在4.09.0范围内。如温度超过范围内。如温度超过 60或或pH降到降到3.0以下，或加入解离剂台硫氰化钾、以下，或加入解离剂台硫氰化钾、 尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的尿素等，则抗原抗体复合物又可重新解离，解离后的 抗原或抗体性质不改变。抗原或抗体性质不改变。 血清

11、学反应试验23 抗原抗体反应一般规律 最适比和带现象最适比和带现象 只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合 反应。反应。 当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成当抗原过多或抗体过多，则抗原抗体的结合不能形成 大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称大的复合物，因而抑制可见反应的出现，这一现象称 为带现象。为带现象。 抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出抗体过多出现的抑制现象称前带现象，而抗原过多出 现的抑制现象称后带现象。现的抑制现象称后带现象。 为了克服带现象，在进行血清学试验时，需将抗原或为了克服带现象，在进行血

12、清学试验时，需将抗原或 抗体作适当稀释。抗体作适当稀释。 血清学反应试验24 抗原抗体反应一般规律 反应的二阶段性反应的二阶段性 结合阶段结合阶段-反应发生快，几秒钟至几分钟反应发生快，几秒钟至几分钟 。 反应阶段反应阶段-较慢，需几分钟、几十分钟或更长时较慢，需几分钟、几十分钟或更长时 间间 。 血清学反应试验25 凝集反应 颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或颗粒性抗原（如细菌、红血球等）或吸附在乳胶、吸附在乳胶、 白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原与其特异性与其特异性 抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见抗体结合后，在有电介质存在时，凝聚成肉眼可见

13、的凝集小块。的凝集小块。 凝集原凝集原凝集素凝集素 直接凝集反应直接凝集反应 玻片法玻片法 试管法试管法 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-凝集反应凝集反应 血清学反应试验26 血清凝集试验 血清学反应试验27 间接凝集反应间接凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免疫无关的小将可溶性抗原（或抗体）吸附于与免疫无关的小 颗粒（载体）表面，加入相应的抗体（或抗原），颗粒（载体）表面，加入相应的抗体（或抗原）， 在适宜条件下，发生凝集反应。在适宜条件下，发生凝集反应。 载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝；载体：动物的红血球；聚苯乙烯乳胶；矽酸铝； 活性炭等。活性炭等。 抗原抗体反应类型抗原

14、抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验28 间接血凝试验间接血凝试验 间接血凝试验间接血凝试验 吸附抗原的红细胞就称为致敏红细胞。致敏红细胞吸附抗原的红细胞就称为致敏红细胞。致敏红细胞 与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集现象。与相应抗体结合后，能出现红细胞凝集现象。 用已知抗原吸附于红细胞上检测未知抗体称为正向用已知抗原吸附于红细胞上检测未知抗体称为正向 间接血凝试验，用已知抗体吸附于红细胞上鉴定未间接血凝试验，用已知抗体吸附于红细胞上鉴定未 知抗原称为反向间接血凝试验。知抗原称为反向间接血凝试验。 常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的常用的红细胞有绵羊、家兔、鸡及人的O O型红

15、细胞。型红细胞。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验29 间接血凝抑制试验间接血凝抑制试验 间接血凝抑制试验间接血凝抑制试验 抗体与游离抗原结合后就不能凝集抗原致敏的红抗体与游离抗原结合后就不能凝集抗原致敏的红 细胞，从而使红细胞凝集现象受到抑制，这一试细胞，从而使红细胞凝集现象受到抑制，这一试 验被称为间接血凝抑制试验验被称为间接血凝抑制试验 。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验30 乳胶凝集试验乳胶凝集试验 乳胶凝集试验乳胶凝集试验 以乳胶颗粒作为载体的间接凝集试验，称为以乳胶颗粒作为载体的间接凝集试验，称为

16、 乳胶凝集试验。该试验既可检测相应的抗体也可乳胶凝集试验。该试验既可检测相应的抗体也可 鉴定未知的抗原，而且方法简便、快速，在临床鉴定未知的抗原，而且方法简便、快速，在临床 诊断中广泛应用于伪狂犬病、流行性乙型脑炎、诊断中广泛应用于伪狂犬病、流行性乙型脑炎、 钩端螺旋体病、猪细小病毒病、猪传染性萎缩性钩端螺旋体病、猪细小病毒病、猪传染性萎缩性 鼻炎、禽衣原体病、山羊传染性胸膜肺炎、囊虫鼻炎、禽衣原体病、山羊传染性胸膜肺炎、囊虫 病等的诊断。病等的诊断。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验31 协同凝集试验协同凝集试验 协同凝集试验协同凝集试验 葡萄球菌葡

17、萄球菌A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌的蛋白是大多数金黄色葡萄球菌的 特异性表面抗原，能与多种哺乳动物血清中的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物血清中的 IgG分子的分子的Fc片段相结合，结合后的片段相结合，结合后的IgG仍保持其仍保持其 抗体活性。当这种覆盖着特异性抗体的葡萄球菌抗体活性。当这种覆盖着特异性抗体的葡萄球菌 与相应抗原结合时，可以相互连接引起协同凝集与相应抗原结合时，可以相互连接引起协同凝集 反应，在玻板上数分钟内即可判定结果反应，在玻板上数分钟内即可判定结果(加图图加图图 八八)。目前已广泛应用于快速鉴定细菌、霉形体和。目前已广泛应用于快速鉴定细菌、霉形体和 病毒等病毒等 抗原抗体

18、反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验32 碳粉凝集试验碳粉凝集试验 炭粉凝集试验炭粉凝集试验 以极细的活性炭粉作为载体的间接凝集试验，以极细的活性炭粉作为载体的间接凝集试验， 称为炭粉凝集试验。反应在玻板上或塑料反应盘称为炭粉凝集试验。反应在玻板上或塑料反应盘 进行，数分钟后即可判定结果。通常是用抗体致进行，数分钟后即可判定结果。通常是用抗体致 敏炭粉颗粒制成炭素血清，用以检测抗原，如马敏炭粉颗粒制成炭素血清，用以检测抗原，如马 流产沙门氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以检测流产沙门氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以检测 抗体，如腺病毒感染、沙门氏菌病、大肠杆菌病、抗体，

19、如腺病毒感染、沙门氏菌病、大肠杆菌病、 囊虫病等的诊断。囊虫病等的诊断。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-间接凝集反应间接凝集反应 血清学反应试验33 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应 （precipitation reaction) 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂 解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等） 与相应的抗体结合，在适量电介质存在下，形成与相应的抗体结合，在适量电介质存在下，形成 肉眼可见的细微的白色沉淀。肉眼可见的细微的白色沉淀。 血清学反应试验34 抗原抗体

20、反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应 （precipitation reaction) 可溶性可溶性抗原抗原+相应抗体相应抗体 肉眼可见的沉淀肉眼可见的沉淀 血清学反应试验35 沉淀反应沉淀反应 环状沉淀反应环状沉淀反应 絮状沉淀反应絮状沉淀反应 抗原 沉淀环 抗血清 抗原抗血清混 合 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-沉淀反应沉淀反应 常用于毒素、类毒素常用于毒素、类毒素 和抗毒素的定量测定和抗毒素的定量测定 主要用于抗原的定性试验，如炭疽主要用于抗原的定性试验，如炭疽 病的诊断（病的诊断（Ascoli氏试验）、链球氏试验）、链球 菌的血清型鉴定和血迹鉴定等菌的血清型鉴定和血迹鉴定等

21、血清学反应试验36 沉淀反应沉淀反应 沉淀反应沉淀反应-凝胶扩散试验凝胶扩散试验：1%琼脂凝胶的孔径 约85毫微米，可允许各种抗原抗体自由扩散。由近及远形成 浓度梯度。 单向单扩散单向单扩散 单向双扩散单向双扩散 抗原 抗血清+琼脂 抗原 琼脂 抗血清+琼脂 血清学反应试验37 沉淀反应沉淀反应 沉淀反应沉淀反应-琼脂扩散试验琼脂扩散试验： 双向单扩散双向单扩散 双向双扩散双向双扩散 抗血清+琼脂 抗原 沉淀线 孔径3mm 抗原 待检血清 标准阳性抗血清 血清学反应试验38 单向免疫扩散 血清学反应试验39 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ； C：

22、Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E： 浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab 沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系 双向琼脂扩散 血清学反应试验40 (1) 沉淀线吻合：待检抗原与沉淀线吻合：待检抗原与 标准抗原完全相同。标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切：待检抗原中沉淀线相切：待检抗原中 含有与标准抗原相同的抗原，含有与标准抗原相同的抗原， 还含有另外的抗原与抗血清相还含有另外的抗原与抗血清相 对应。对应。 (3) 沉淀线相交：待检抗原有沉淀线相交：待检抗原有 与抗血清对应的抗原，但和标与抗血清对应的抗

23、原，但和标 准抗原不同。准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合：待测抗沉淀线部分吻合：待测抗 原和标准抗原性质相同，但含原和标准抗原性质相同，但含 量较低。量较低。 A1：待检抗原；A2：标准抗原 双响琼脂扩散 血清学反应试验41 抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体的最高稀释倍数为该抗体 的效价。的效价。 血清学反应试验42 对流免疫电泳对流免疫电泳 在pH为8.6的琼脂凝胶板上打孔，两孔为一组，孔径3mm，抗原、 抗体孔间距为45mm。将抗原加入负极端

24、孔内，抗体加入正极 端孔内，用24mA/cm电流电泳1h左右，观察结果，在两孔之 间出现沉淀带的为阳性反应 。 血清学反应试验43 在在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只 带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小，带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小， 小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强 的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向 正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原

25、抗 体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相 遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。遇，在比例适当处形成肉眼可见的沉淀线。 对流免疫电泳原理对流免疫电泳原理 血清学反应试验44 对流免疫电泳结果判定 1为阳性 2为弱阳性 3/4为强阳性 血清学反应试验45 对流电泳方法评价对流电泳方法评价 简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高简便、快速、敏感度较双向琼脂扩散试验高 810倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。倍，但分辨力低于双向琼脂扩散试验。 血清学反应试验46 火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis, RIE)

26、 血清学反应试验47 火箭免疫电泳火箭免疫电泳 火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清 学试验。是让抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中 定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉 淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。 血清学反应试验48 火箭免疫操作步骤火箭免疫操作步骤 1. 制备抗体琼脂糖凝胶板制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的将已融化的1.2%巴比妥缓冲琼脂糖冷巴比妥缓冲琼脂糖冷 却至却至55左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。 2. 打孔打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距

27、，孔距2mm。置琼脂。置琼脂 板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10l。 3. 电泳电泳 样品孔放负极侧，电压样品孔放负极侧，电压810V/cm或电流或电流35mA/cm，电，电 泳泳6h。 4. 观察沉淀峰观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔 中心到峰尖的高度。中心到峰尖的高度。 5. 绘制标准曲线图绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标对数坐标)， 绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度 血清学反应试验49

28、火箭免疫结果火箭免疫结果 若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合的若抗原与抗体比例合适，则孔前出现顶端完全闭合的 火箭状沉淀峰；抗原大量过剩时或不形成沉淀峰，或火箭状沉淀峰；抗原大量过剩时或不形成沉淀峰，或 沉淀峰不闭合；抗原中等过剩时沉淀峰呈圆形；当二沉淀峰不闭合；抗原中等过剩时沉淀峰呈圆形；当二 者比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰。者比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰。 血清学反应试验50 火箭免疫电泳方法评价火箭免疫电泳方法评价 火箭电泳是一种操作简便、省时、结果重复性好的火箭电泳是一种操作简便、省时、结果重复性好的 定量检测方法。其敏感度可测定量检测方法。其敏感度可测0.3

29、mg/L抗原含量，抗原含量， 若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。如加入少若低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。如加入少 量量125I标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳，形成标记的抗原在含抗体的琼脂板上电泳，形成 的不可见火箭峰，经洗涤干燥后，用的不可见火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片感光，线胶片感光， 经显影和定影，可呈现同位素显影，这就是放射自经显影和定影，可呈现同位素显影，这就是放射自 显影技术，可用于微量抗原含量测定，如测定血清显影技术，可用于微量抗原含量测定，如测定血清 AFP或或IgE含量，可测至含量，可测至g/L水平。水平。 血清学反应试验51 免疫电泳免疫电泳(immunoelec

30、trophoresis, IEP) 是将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化是将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化 学分析技术。学分析技术。 血清学反应试验52 免 疫 电 泳 示 意 图 血清学反应试验53 免疫电泳操作步骤免疫电泳操作步骤 1. 取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖槽。 2. 用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。 3. 电泳条件以电压电泳条件以电压46V/cm或电流或电流23mA/cm为宜，电泳为宜，电泳 1.52h。 4. 电泳完毕后，用毛细滴管在槽内

31、加入含相应抗原，孵育，电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原，孵育， 使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。 5. 观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、 脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。例如血浆蛋白免 疫电泳。疫电泳。 血清学反应试验54 免疫电泳方法评价免疫电泳方法评价 免疫电泳分辨率高，可分出人血清中免疫电泳分辨率高，可分出人血清中2030种抗原种抗原 成分，可鉴定混合抗原中各组分。成分，可鉴定混合抗原中各组分。 血清学反应试验55 补体结合反

32、应 补体特点：补体特点： 补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与 抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细 胞（溶菌或溶血）。胞（溶菌或溶血）。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型-补体结合反应补体结合反应 有补体参加的抗原抗体反应。有补体参加的抗原抗体反应。 血清学反应试验56 补体结合反应补体结合反应 抗原抗原 + + 抗体抗体抗原抗体复合物抗原抗体复合物 补体补体 羊红细胞羊红细胞 + +溶血素溶血素羊红细胞溶血素复合物羊红细胞溶血素复合物 （不溶血）（不溶血） 抗原抗原 + + 抗体抗体 不

33、结合不结合 羊红细胞羊红细胞 + +溶血素溶血素羊红细胞溶血素复合物羊红细胞溶血素复合物 （溶血）（溶血） 补体补体 指示系统： 反应系统： 血清学反应试验57 补体结合反应 血清学反应试验58 标记抗原抗体反应 可用放射性同位素、荧光素或酶等标记抗可用放射性同位素、荧光素或酶等标记抗 原或抗体。原或抗体。 抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型 -标记抗原抗体反应标记抗原抗体反应 血清学反应试验59 免疫荧光技术免疫荧光技术 是用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应是用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应 抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察荧光以抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察荧光以

34、 分析示踪相应的抗原或抗体的方法。分析示踪相应的抗原或抗体的方法。 常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（FITC），）， 此外还有四乙基罗丹明（此外还有四乙基罗丹明（RB200）、四甲基异硫氰）、四甲基异硫氰 酸罗丹明（酸罗丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基荧光素）和三氯三嗪基氨基荧光素 （DTAF）等）等 。 血清学反应试验60 免免 疫疫 荧荧 光光 法法 血清学反应试验61 荧光标记法荧光标记法 抗原 抗体 抗原 抗抗体 抗体 直接免疫荧光法直接免疫荧光法 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 血清学反应试验62 酶标记抗体技术（免疫酶技术）酶标记抗体技术（免疫酶技

35、术） 是利用抗原抗体的特异性结合和酶的高效特异的催化是利用抗原抗体的特异性结合和酶的高效特异的催化 作用显色而建立起来的免疫检测技术。作用显色而建立起来的免疫检测技术。 常用的标记酶是辣根过氧化物酶（常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP），其作用），其作用 底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，常用的供氢体底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，常用的供氢体 有有3，3-二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（DAB）和邻苯二胺（）和邻苯二胺（OPD），）， 前者反应后形成不溶性的棕色物质，适用于免疫酶组前者反应后形成不溶性的棕色物质，适用于免疫酶组 化法；后者反应后形成可溶性的橙色产物，敏感性高，化法；后者反应后

36、形成可溶性的橙色产物，敏感性高， 易被酸终止反应，呈现的颜色可数小时不变，是易被酸终止反应，呈现的颜色可数小时不变，是 ELISA中常用的供氢体。中常用的供氢体。 血清学反应试验63 酶标记抗体技术（免疫酶技术）酶标记抗体技术（免疫酶技术） 直接法直接法 用用酶标记抗体酶标记抗体直接处理含待检抗原的标本，洗涤后浸于含直接处理含待检抗原的标本，洗涤后浸于含 有过氧化氢和有过氧化氢和DAB的显色反应液中作用，然后在普通光学显的显色反应液中作用，然后在普通光学显 微镜下观察颜色反应，抗原所在部位呈棕黄色。微镜下观察颜色反应，抗原所在部位呈棕黄色。 间接法间接法 含待检抗原的标本先用未标记的抗血清处理

37、，洗涤后再用含待检抗原的标本先用未标记的抗血清处理，洗涤后再用 相应的相应的酶标记抗抗体酶标记抗抗体处理，洗涤，然后浸于含有过氧化氢和处理，洗涤，然后浸于含有过氧化氢和 DAB的显色反应液中作用，普通光学显微镜下观察颜色反应，的显色反应液中作用，普通光学显微镜下观察颜色反应， 以指示是否有抗原以指示是否有抗原-抗体抗体-抗抗体复合物存在抗抗体复合物存在 。 血清学反应试验64 酶联免疫吸附试验（简称酶联免疫吸附试验（简称ELISA） 将抗原或抗体吸附于将抗原或抗体吸附于固相载体固相载体的表面，酶标记物的表面，酶标记物 与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标记抗原抗与相应的抗体或抗原反应后，形成酶标

38、记抗原抗 体复合物，在遇到相应底物时，结合物上的酶催体复合物，在遇到相应底物时，结合物上的酶催 化底物产生水解、氧化或还原等反应，从而生成化底物产生水解、氧化或还原等反应，从而生成 可溶性或不溶性的有色物质，可用肉眼或酶标测可溶性或不溶性的有色物质，可用肉眼或酶标测 定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或抗原定仪判定结果。颜色的深浅与相应的抗体或抗原 量成正比，因此，可根据颜色的深浅来定量抗体量成正比，因此，可根据颜色的深浅来定量抗体 或抗原。或抗原。 血清学反应试验65 直接法直接法 将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的 抗原，加入一定量的抗原

39、，加入一定量的酶标记抗体酶标记抗体与样品与样品(含有抗含有抗 原原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体 表面形成抗原表面形成抗原-抗体抗体-酶复合物。洗除多余部分，酶复合物。洗除多余部分， 加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降 解应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶解应，产生有色物质。通过酶标检测仪，测出酶 底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 血清学反应试验66 间接法间接法 将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，将已知抗原吸附在固相载体表面，

40、洗除未吸附抗原， 加入一定量抗体与待测样品加入一定量抗体与待测样品(含有抗原含有抗原)提取液的混提取液的混 合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体抗体 复合物。洗除多余抗体成分，然后加入复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗酶标记的抗 抗体抗体，与吸附在固体表面的抗原，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，抗体复合物相结合， 再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物发生降解再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物发生降解 反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物 的降解量，从而推知被测样品中的抗原

41、量。的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 血清学反应试验67 斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验 以纤维素薄膜为固相载体，在膜上进行免疫酶反以纤维素薄膜为固相载体，在膜上进行免疫酶反 应。先将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通应。先将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通 过相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列反应，过相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列反应， 形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合形成酶标记抗原抗体复合物，加入底物后，结合 物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色 物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出物质，沉着于抗原抗体复合物吸附部位，呈现出 肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过颜色斑点肉眼可见的颜色斑点，试验结果可通过颜色斑点 的出现与否和色泽深浅进行