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文档简介

1、会计学1酶切回收连接酶切回收连接第1页/共21页限制性核酸内切酶第2页/共21页第3页/共21页产生3粘性末端第4页/共21页GTCCAGGTCGACCAGCTGGACCTG第5页/共21页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名：Hind Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序v书写方法：前3个字母斜体第6页/共21页第7页/共21页第8页/共21页DNA的量酶的用量（U/C）酶在50甘油中，甘油在总体积的浓度要小于5反应的总体积Buffe

2、r的体积水的体积第9页/共21页Hind III (20U/l) 1.5 l 10 缓冲液 E 3l 三蒸水 9l _总体积 30l XbaI（20U/l 1.5 l 加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。第10页/共21页第11页/共21页第12页/共21页载体 DNA目的基因第13页/共21页 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 第14页/共21页酚抽提法1.切下含目的DNA的胶块。2.加入酚，将胶块没过即可。3.振荡后低温冻结，视温度而定时间。4.30水浴融化，若体积小，可补加TE。5.振荡器上振荡。6.12,000 rpm离心5 min。7.取上清

3、200l。第15页/共21页8.用200l的氯仿：异戊醇抽提（振荡，离心12000 rpm，5 min，取上清）。9.加20 l NaAc，400 l无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30 min甚至过夜。10.12,000 rpm离心10 min，弃上清。11.将DNA溶于约30l TE中。第16页/共21页DNA片段的连接反应第17页/共21页 催化DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键(ATP)5533OH POHPDNA连接酶DNA连接酶第18页/共21页总体积20 l 载体 0.10.2g目的基因：载体mol数= 15：1H2O10buffer载体目的基因ligase总体积20l l l l l l 第19页/共21页连接应注意的事项：1.目的基因与载体的mol数

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