鸡的大小黄白卵泡的分离和总RNA提取

1、鸡的大小黄白卵泡的分离及总RNA的提取鸡的大小黄白卵泡分离及总RNA的提取目录中文摘要：2关键词：2Abstract：2前言21.材料和方法41.1实验动物及其组织41.2主要仪器和试剂41.2.1实验仪器41.2.2实验试剂41.2.3溶液配制51.3实验操作步骤51.3.1取样51.3.2大小黄白卵泡的提取61.3.3总RNA的提取61.3.4总RNA完整性鉴定61.3.5 总RNA内基因组DNA的去除61.3.6反转录反应71.3.7 PCR反应71.3.8 电泳检测71.3.9 PCR产物纯化71.3.10 连接转化82.实验结论82.1 鸡卵泡颗粒细胞82.2 总RNA的检测结果92

2、.3 PCR检测93.分析讨论104.参考文献12中文摘要：实验前,在大量查阅各项相关研究资料的前提下，明确了CART与蛋鸡卵巢中不同大小黄白卵泡中的雌激素（Estrodiol, E2）和孕酮（P）分泌量的关系。本实验运用显微外科手术技术分离蛋鸡的大小黄卵泡、大小白卵泡，并分别进行总RNA的提取，通过CART mRNA表达量的差异对CART蛋白进行定位，再通过体外注射dsRNA对CART的表达进行抑制，阻断CART对蛋鸡卵巢中卵泡生长发育及排卵的影响，从而提高蛋鸡产蛋量，延长产蛋周期，降低料蛋比，进而通过饲养试验，确定调控效果，并将该技术进行全面示范推广。关键词：CART；卵泡；总RNA；ds

3、RNA；Abstract： According to the information of related research before experiments, we found out the relationships between the amount of estrogen(E2) and progesterone(P), which the layers follicle in different size secreted ,and CART. During this experiment ,we used the microsurgical technique to iso

4、late different follicles including Rhubarb follicle(LYF) , Small white follicle (SWF), yellow follicle (SYF) and the follicle (LWF).Otherwise, we have picked up the total RNA respectively and located the CART protein through the different amount of CART expression. Finally, we have suppressed the in

5、fluences of CART on the follicles growth and ovulation in ovarian by means of injecting dsRNA artificially .As to improve the layers production, prolong period of laying and reduce the ratio of forage and eggs, we conducted the feeding experiments and determined the effect of the results, and then a

6、pply comprehensively to the actual producatons.Key words：CART(Classification And Regression Tree)；folliole；total RNA；前言 我国蛋鸡已由上世纪8090年代的数量蓬勃发展阶段，逐步进入微利时代，蛋鸡养殖的行业优势、价格优势也日趋降低，并开始按发展竞争平稳运行三个阶段经济模式运作。目前蛋鸡产业在精细化的管理、先进技术的应用及市场信息的支撑方面，逐渐发展成熟、完善。因此，要想提高蛋鸡养殖利润就要从根本上提高蛋鸡的产蛋量，降低料蛋比。卵巢周期是产蛋过程的中心事件，只有成熟卵巢的卵泡才能释

7、放卵子，然而，大于99%的卵巢卵泡在其发生过程中死亡而不能排卵。促卵泡素（FSH）启动原始卵泡发育后，又进一步促进部分卵泡形成腔，进入有腔卵泡的生长期。在对牛的卵泡发育研究中表明，当原始卵泡发育到了34mm有腔卵泡期，通常就会出现一次FSH水平的瞬时提高。有腔卵泡的继续生长依赖于FSH的支持，FSH刺激有腔卵泡的生长发育，同时又刺激颗粒细胞产生FSH受体（FSHR），随着FSHR数量的增加，卵泡颗粒细胞对FSHR反应也就越大，从而促使颗粒细胞不断发育。FSH短暂的增加，并刺激一群小的有腔卵泡开始发育，这是一个卵泡发育波的开始，其中只有一个优势卵泡继续发育到排卵的大小，这时FSH的浓度下降，并产

8、生大量的雌激素（Estrodiol, E2），而其余的从属卵泡失去了产生E2的能力，并通过卵泡闭锁而死亡。近年来许多实验证明，在卵泡发育过程中，雌激素起着关键作用。E2不仅能提高卵泡对FSH的摄取，而且还可以通过提高FSH的浓度来刺激cAMP的积累能力，从而进一步提高卵巢卵泡颗粒细胞对FSH的反应性，还能增进FSH刺激其受体作用，能使颗粒细胞促黄体生成素受体明显增加，大大提高卵泡对两种促性腺激素的反应性，最终促使卵泡发育成熟并排卵。卵巢内卵泡E2产生能力的丧失导致卵泡闭锁。卵巢内雌激素产生是垂体促性腺激素和卵泡内调控分子的相互作用调控的，如类固醇激素和生长因子。蛋鸡卵巢大约包含4000个原始卵

9、泡，每个原始卵泡都有潜力形成一枚蛋黄，但只有不足1/4卵泡能够发育成熟和排卵，而蛋鸡企业中每只蛋鸡产蛋期内排卵约500550枚，卵巢上大量参与发育的卵泡在其发生过程中闭锁和退化。卵泡发育过程中，垂体分泌的促性腺激素（E2和FSH）起着重要作用，促进卵母细胞的生长、卵泡细胞的增殖和卵泡腔的形成以及诱导卵泡排卵、黄体生成。近年来实验证明甾类激素，特别是E2对调控卵泡发育和黄体生成过程也起着重要的作用。蛋鸡卵巢E2对于卵泡的递次发育具有重要的调节作用，当卵巢上有最大卵泡存在的时候，其分泌的E2在垂体前叶抑制FSH和排卵诱导素（OIH）的分泌，对其它中小卵泡的发育起到抑制作用。但是，在高产家禽，其体内

10、E2的含量也相对较高，因为这些家禽的卵巢上同时有数量较多的大中型卵泡存在，而E2主要是由大中型卵泡分泌的。而孕酮（P）能够刺激卵泡壁细胞的蛋白分解酶和胶原水解酶的合成，这两种酶分解卵泡壁细胞而引发排卵。同时，P对OIH的释放也有作用。大剂量的P由于能够抑制FSH和OIH的分泌，对卵泡发育和排卵会起到抑制作用。CART是近年来在动物体内发现的一种内源性神经肽，参与人和动物多方面的生理功能。Spiess等 (1981) 在羊下丘脑的抽提物中分离出CART，Western Blotting 也证实了CART肽在脑、内脏、肾上腺、垂体等处均有分布。近年来美国密歇根大学研究人员在对牛的研究中首次证实CA

11、RT对卵泡健康状况有负调节作用，并且CART对牛颗粒细胞产生的E2的基本含量也有负调控作用。同时，CART抑制牛颗粒细胞内由FSH诱导的cAMP水平、E2的积累和芳构化酶信使RNA水平的升高，从而引起颗粒细胞的凋亡并最终引起卵母细胞的闭锁。李鹏飞（2011）以猪、羊为研究对象，首次证明了CART在猪、羊卵巢中有表达，并对该基因全CDS区进行了克隆与表达载体的构建，目前已通过对猪、绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养，研究CART与E2产生的相互关系。dsRNA是一种有互补链的RNA，与细胞中发现的DNA相似，dsRNA能够促发真核细胞中的RNA干扰，在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制，引起脊椎动物

12、中的干扰素反应。目前RNA干扰技术在科学界受到极大关注，主要是因为该项技术在干扰基因功能和相关方面的应用中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势：（1）特异性 dsRNA干扰技术的最显著特征就是只引起与dsRNA同源的mRNA降解。实验表明，dsRNA能稳定表达的转基因和细胞内自身固有的内源基因表达，而对其它无关基因的表达不受影响；（2）高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA就能有效的抑制靶基因表达，其介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的；（3）dsRNA长度限制性 引发有效的RNA干扰的dsRNA最短不得短于21碱基，同时长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为2

13、1nt左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割；（4）可传播性 dsRNA具有跨越细胞界限的能力，在局部注射dsRNA，能够传播到整个机体；（5）ATP依赖性 dsRNA干扰是一个ATP依赖的过程，整个过程由ATP提供能量。目前虽然仍未找到CART的受体，但已经明确CART实现其生物学功能的途径就是与其受体结合，如果通过阻断CART与其受体结合或能够抑制CART的合成和表达，对于蛋鸡产业而言，无疑是一项重大技术发现。1.材料和方法1.1实验动物及其组织本实验材料均来自晋中市太谷县屠宰场。选取十只健康蛋鸡组成实验群。待蛋鸡宰杀后，取下所有的十个卵巢，投入冰盒中制备好的杜氏磷酸缓冲液（D

14、PBS）中，迅速带回实验室。1.2主要仪器和试剂1.2.1实验仪器表一 实验仪器仪器名称型号生产厂家制冰机SIM-F124SANYO超低温冰箱UF-3410Thermo超净工作台DL-CG-2ND哈东联电热恒温干燥箱DEF-6210上海一恒高速冷冻离心机Centrifuge 5810REppendorf凝胶成像分析系统GBS-7600BBIO-RADPCR 扩增仪 PTC200TaKaRa电泳仪、电泳槽DYY-12B六一核酸蛋白检测系统ND-100Nanodrop恒温振荡培养箱LRH-250E广东医疗器械厂超纯水系统NW10VFHealforce将需要清除RNase枪头、离心管等放入固相RNa

15、se清除剂工作液浸泡5 min以上，烘干备用。1.2.2实验试剂表二.实验试剂试剂货号出产公司固相RNase清除剂107105zyhAndybioTotal RNA提取试剂D9108ATakara反转录试剂盒DRR047ATakara胶回收试剂盒DV805A Takara连接转化试剂盒D102ATakara感受态大肠杆菌DH5D9057TakaraTaq DNA PolymeraseET101-01北京天根生化科技有限公司dNTP MixtureCD117北京天根生化科技有限公司1.2.3溶液配制(1) DPBS溶液：500 mL 蒸馏水 + 4 g NaCl + 0.1 gKCl + 0.1

16、 g KH2PO4 + 0.575 g Na2HPO4，溶解后高压灭菌备用。(2) 50 TAE Buffer：242 g Tris，37.2g EDTANa2，57.1 mL冰乙酸，NaOH溶液调pH至8.3，加去离子水定容至1 L后室温保存。使用时稀释50倍。(3) 固相RNase清除剂：将蒸馏水与固相RNase清除剂按1000:1配制，室温下可保存24 h。(4) EB储液 (10 mg/mL)：1 g EB溶于100 mL去离子水，4 棕色瓶避光保存。(5) LB液培养基1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，NaOH调pH至7.4，去离子水定容至1L

17、，高温高压湿热灭菌后4 保存，用前37 平衡。(6) LB固体培养基1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，Agar 15 g，NaOH调pH至7.4，去离子水定容至1000mL，高温高压湿热灭菌，温度至60 65 铺板，冷却后4 保存，用前37 平衡。(7) 氨苄青霉素(100 mg/mL)：氨苄青霉素5 g，灭菌水定容至50 mL，0.22 mm过滤膜过滤除菌，保存于20 。(8) X-Gal (20 mg/ml)：1 g X-Gal，二甲基甲酰胺定容至50 mL，20 保存。(9) IPTG (24 mg/mL)：IPTG 1.2 g，灭菌水定容至50 m

18、L，0.22 mm过滤膜过滤除菌，20 保存。1.3实验操作步骤1.3.1取样（1）取卵泡：在细胞培养室将盛70%酒精和DPBS溶液两个小培养皿放于纸巾上，一小烧杯内盛少量的培养液放于冰上。用眼科手术剪轻轻剪取2 8 mm卵泡，将剪下的卵泡在70%酒精和DPBS溶液中各浸数秒后，用镊子夹入盛有培养液的烧杯内。（2）刮取颗粒细胞：超净台内放入盛冰的大烧杯，内放盛有卵泡的小烧杯和几只采血管，针管和胶头滴管放入采血管内。灭菌好的表面皿、刮刀、小剪刀、两把镊子和垃圾杯放入超净台内。将卵泡夹入表面皿，注入少量培养液，镊子夹住卵泡用针管刺破，小剪刀剪开卵泡后刮刀刮其内壁将颗粒细胞刮下，胶头滴管吸取细胞悬液

19、至采血管中，残留物弃于垃圾杯，如此反复。1.3.2大小黄白卵泡的提取禽类卵泡发育成熟的过程中具有优先等级的特点，即卵泡从小到大按排卵次序排列。鸡的卵泡一般按直径大小分类，等级前卵泡可分为:小白卵泡(SWF，2mm)、大白卵泡(LWF，35mm)、小黄卵泡(SYF，68mm)和大黄卵泡(LYF，912mm)。由于卵泡膜都非常薄，所以通过显微外科手术获得完整的不同大小的黄、白卵泡，在技术上要求较高。1.3.3总RNA的提取(1) 在分别装有大小黄白卵泡的1.5 mL EP管内加入300 mL Trizol，不停吹打直至细胞充分裂解，固形物消失，室温静置5 min。(2) 向上一步的细胞裂解液中加1

20、/5体积量Trizol的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s。待溶液充分乳化后，室温静置5 min。(3) 12,000 g，4 离心15 min。(4) 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及下层带有颜色的有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中。(5) 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在15 30 下静置10 min。 (6) 12,000 g ,4 离心10 min。(7) 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇l mL (勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g，4 离心5 min后小心弃去乙醇。(8

21、) 室温干燥沉淀2 5 min，加入30 mL RNase Free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 保存。1.3.4总RNA完整性鉴定（1）OD260/OD280比值测定：经微量核酸蛋白测定仪OD260/OD280比值在1.8 2.0之间。初步确定样品Total RNA完整性较好。（2）大小黄白卵泡Total RNA电泳：取50 mL RNase Free加入1 mL 50 TAE Buffer，0.5 g 琼脂糖，煮沸，稍凉后加入两滴EB，凝固，制成1% RNA电泳用胶。将RNA专用电泳槽用固相RNase清除剂工作液处理5 min以上，加入无RNase的TA

22、E工作液。Total RNA 5mL与1mL Loading Buffer混合后点样。电压200V以上，电泳十分钟左右。经电泳检测，total RNA的28S、18S和5S三条带可见，证明total RNA完整性良好。28S、18S、5S分别具有4700、1900、120个核苷酸。1.3.5 总RNA内基因组DNA的去除使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒。试剂添加：2 mL 的5gDNA Eraser Buffer；1 mL的gDNA Eraser；1 mg的Total RNA；加RNase Free dH2O至总量为10 mL 。

23、 反应条件：42 2 min4 1.3.6反转录反应使用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒。试剂添加：4 mL的5PrimeScript Buffer 2，1 mL的PrimeScript RT Enzyme Mix I；1 mL的RT Primer Mix；10 mL去除基因组DNA后的Total RNA，加RNase Free dH2O至总量为 20 mL。1.3.7 PCR反应使用天根公司Taq DNA Polymerase(含10Taq Buffer)、dNTP Mixture。试剂添加：1 mL 的Forwar

24、d Primer；1 mL的Reverse Primer；2 mL的10Taq Buffer；1.6 mL的dNTP Mixture，0.4 mL的Taq DNA Polymerase；2 mL的cDNA；1.5 mL的MgCl2；加H2O至总量为20 uL。反应条件：94 2 min94 5 s60 30 s 35 循环72 30 s72 2 min1.3.8 电泳检测50mL 蒸馏水加入1 mL 50 TAE Buffer，0.5 g 琼脂糖，煮沸，稍凉后加入2滴EB，凝固，制成1% DNA电泳用胶。5 mL PCR产物与1 mL Loading Buffer混合后点样。电压130 V，电

25、泳30 min。1.3.9 PCR产物纯化用100 mL PCR产物电泳后，进行胶回收。步骤如下：(1) 在紫外灯下将目的条带切下，切碎后称重。1 mg = 1 mL计算胶块体积。(2) 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。1%浓度的胶加入3个凝胶体积量的DR-I Buffer；1% 1.5%的胶加4个凝胶体积量；1.5% 2%的胶加5个凝胶体积量。(3) 均匀混合后75 加热融化胶块。此时应间断振荡混合6 10 min，使胶块充分融化。(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在

26、此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。(5) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作4的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中离心一次，以提高DNA的回收率。(6) 将500 mL的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 s，弃滤液。(7) 将700 mL的Rinse B (预先加入制定体积的无水乙醇) 加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 s，弃滤液。(8) 重复操作步骤7。(9) 将Spin Column安置于C

27、ollection Tube上，12,000 rpm离心1 min。(10) 将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 mL的60 灭菌蒸馏水或60 Elution Buffer，室温静置1 min。(11) 12,000 rpm离心1min洗脱DNA。(12) 纯化后的PCR产物存放于20 备用。1.3.10 连接转化使用Takara公司的pMD19-T Vector试剂盒与Takara公司的感受态大肠杆菌DH5。所有操作在冰上进行，操作步骤如下：(1) 在微量离心管中配制下列DNA溶液：1 mL 的pMD19-T Vector；0

28、.1 pmol 0.3 pmol的 Insert DNA；加dH2O至总量为5 L。(2) 加入5 L(等量)的Solution I。(3) 16 反应30 min。(4) 全量 (10 L)加入至100 L感受态大肠杆菌DH5中，冰中放置30 min。(5) 42 加热约1min，再在冰中放置约2 min。(6) 加入约1mL无抗的SOC培养基，37 振荡培养60 min，使大肠杆菌复苏。(7) 取约200 L复苏后的大肠杆菌涂在含X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上，37 培养约12 h。(8) 将长出菌落的培养板放4 约一天时间，让蓝色菌落充分显色。(9) 挑取白色单克隆菌落在

29、SOC培养基中37 扩大培养12 h。(10) 送交菌液去华大公司测序。2.实验结论2.1 鸡卵泡颗粒细胞在促性腺激素等作用的调控下，卵泡中颗粒细胞增殖分化。颗粒细胞合成多种激素及生长因子，并表达其受体，通过间隙连接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长分化和成熟，进而调控卵泡的发育。颗粒细胞的生长分化可以作为卵泡发育的标志。试验中观察到的卵泡颗粒细胞如图1所示。图1 鸡卵泡颗粒细胞（上图为40倍镜观察，下图为100倍镜观察）2.2 总RNA的检测结果为了检测 RNA 的完整性、含量和纯度，吸取从卵泡颗粒细胞中所提取的总 RNA 5L，用1 %琼脂糖凝胶电泳检查，结果有清晰的、无拖尾的两条带（图1），

30、即 5.8 SrRNA 、18SrRNA 和 28SrRNA，说明样品 RNA 是完整的。用核酸浓度测定仪测定结果显示，RNA样品的OD260与OD280比值均在1.82.0之间。带与带之间无明显拖尾现象，表明RNA样品无降解，无明显的DNA、蛋白质、酚等污染，可用于下一步研究使用。图2 总 RNA 的检测2.3 PCR检测 图3 PCR产物检测 3.分析讨论目前我国蛋鸡养殖量居全球第一，数据显示，商品蛋鸡的饲养量估计在15亿只左右。在生产性能能正常发挥的状态下，12亿商品蛋鸡所生产的鸡蛋可以满足国内市场的需求。近年来受疾病的影响，产蛋水平参差不齐，鸡蛋价格仍不稳定。据统计，蛋鸡产业从业人员约

31、为1000万人左右，包括孵化、雏鸡、鸡蛋、蛋品加工、淘汰鸡在内的蛋鸡业年产值突破1500亿元。为其服务的饲料、兽药和疫苗、设备制造业等相关产业跟进快速发展，增加了社会从业人员的就业渠道和就业机会。资料显示，2011年种鸡、蛋鸡、鸡蛋零售、饲料、兽药、疫苗相关产业年产值超过了3500亿元。据有关统计。目前我国的鸡场数量分布如下：蛋鸡祖代场27家、国内蛋鸡育种场34家、父母代蛋种鸡场1200多家、商品代蛋鸡养殖场(户)30多万家、蛋品加工企业500多家、国家级龙头企业7家。可见，提高蛋鸡单产量、降低料蛋比可显著提高我国蛋鸡养殖经济效益。但目前国内外对提高蛋鸡产蛋量、降低料蛋比的研究主要集中在以下几

32、个方面：（1）选择轻型蛋鸡 实践表明，产蛋量相同的母鸡，体重每增加0.25公斤，每年约多耗料3公斤。（2）科学配制日粮 饲料原料要新鲜无霉变，豆类制品要经高温去毒处理。气温高时应提高日粮中蛋白质的含量，天冷时适当增加能量饲料。蛋鸡产蛋初期饲料中的蛋白质含量应稍高于饲养标准，产蛋高峰期应将日粮中蛋白质的含量提高到19。最好将饲料加工成直径0.5厘米的颗粒料，以利于提高饲料的适口性，减少浪费。（3）精心饲喂 据饲养实践，添加饲料时要做到少量多次，每次加料不宜超过料槽的1/3。同时要供给充足洁净的饮水，补喂优质新鲜的青绿多汁饲料。另外，要给蛋鸡提供直径4-5mm的砂粒，让鸡自由采食，以利于食物消化。

33、一般以产蛋高峰为界（40周龄左右），前期限喂量宜小，后期限喂量宜大，控制饲料用量6-10。（4）添加添加剂 在日粮加入油脂、维生素C、色氨酸，可提高蛋鸡产蛋率。（5）科学管理 鸡产蛋前的适宜温度、湿度过高或过低都会导致饲料利用率、产蛋量下降，蛋鸡可采用间隙光照，每天16h，光照强度以鸡能看见觅食为准。同时注意饲养密度要；注意鸡舍卫生，严格消毒，每2个月给鸡群驱1次虫，搞好疫病的免疫接种工作，禁止滥用药物。经常观察鸡群，发现病鸡及时隔离诊治。（6）强制换羽 当蛋鸡产蛋量下降50时，可采取人工手段使鸡体重下降30，让蛋鸡在短时间内换羽，经过40-50d，产蛋量可恢复60，进入第2个产蛋期。另外，在

34、日粮中添加2.5氧化锌，可促进蛋鸡换羽，缩短换羽时间，促其提前产蛋。以上措施在一定程度上能提高蛋鸡产蛋量，但这些措施实际上都属于蛋鸡养殖业管理层面上，未能从根本上改善蛋鸡养殖业的经济效益。因此，提高蛋鸡养殖利润的有效措施就是从根本上提高蛋鸡产蛋量，降低料蛋比。4.参考文献1 杨玉,黄应祥,曹果青,张桂贤,杨文平. 能量对蛋鸡卵巢促卵泡素受体mRNA表达及产蛋率的影响J. 动物营养学报. 2009(04) 2 倪迎冬,周玉传,卢立志,陈杰,赵茹茜. 绍兴鸭性成熟前卵巢GnRH-I与ER-mRNA表达的发育性变化J. 农业生物技术学报. 2004(06) 3 周玉传,傅启高,赵茹茜,倪迎冬,陈杰. EGH受体、IGF-I型受体、FSH受体和LH受体mRNA在绍鸭各级卵泡颗粒层和膜层中的表达J. 遗传学报. 2003(09) 4 雷雪芹,陈宏,袁志发,雷初朝,徐廷生,孙维斌. 促卵泡生成素受体基因的SNP对牛双胎性状的标记研究J. 云南畜牧兽医. 2002(04) 5 傅衍,牛冬,阮晖,余旭平,陈功,何国庆.