基因工程载体质粒

1、2021/3/101基基 因因 工工 程程 载体载体 南 京 农 业 大 学 陈 溥 言2021/3/102 概概 述述 基因工程是利用酶学方法将不同来源的基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或或cDNA，在体外切割、修饰、连接插，在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中，进行扩入到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表达，研究基因结构和功能，基因和增和表达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。蛋白质关系的一种分子生物学技术。2021/3/103 载体 基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA

2、，并可送入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。2021/3/104 目前的载体主要有目前的载体主要有： 1,质粒（质粒（Plasmid）载体）载体2,入噬菌体入噬菌体3,柯斯质粒（柯斯质粒（Cosmid）4,M13噬菌体噬菌体5,杂交质粒杂交质粒6,病毒载体，包括穿梭载体（病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）。）。7,细菌人工染色体细菌人工染色体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya，1992 BAC)8,酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC)9,来源

3、于来源于P1的细菌人工染色体（的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、）、10,哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome，Farr，1991）11,人类人工染色体（人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome，Harrington,1997）12,植物人工染色体植物人工染色体(PAC) 2021/3/105质 粒 载 体（Plasmid） 一词最早是由一词最早是由Lederberg，1952年提出的。年提出的。是双链、

4、闭环是双链、闭环DNA复制子（复制子（replicon）, ,存在于存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外细菌的细胞质中并独立于染色体之外, ,能自主复能自主复制的一类制的一类DNA。 酵母的杀伤质粒（酵母的杀伤质粒（Killer Plasmid）是例外）是例外, ,它是一种它是一种RNA复制子。根据复制子。根据导链霉菌中存在导链霉菌中存在 线状质粒线状质粒 。质粒是细菌复制。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型表型。 2021/3/106 质粒

5、载体质粒载体l 质粒质粒DNA的一般特点：的一般特点： 质粒质粒DNA可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。 占总的基因组的占总的基因组的13%。 所有原核生物都有质粒。所有原核生物都有质粒。 赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。 隐蔽质粒隐蔽质粒(Cryptic plasmid)。 质粒都是双链闭环质粒都是双链闭环DNA复制子，酵母的杀伤质粒例外复制子，酵母的杀伤质粒例外(RNA)。 2021/3/107质粒的一般生物学性质质粒的一般生物学性质 1969年年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松

6、驰型控制的质粒。主提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数的拷贝数多少划分的。多少划分的。严紧型质粒严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含1060个拷贝的质粒；个拷贝的质粒；松驰型质粒松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高的拷贝数高,一种质一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复制不仅受自身的制约，而且

7、还受寄主菌的控制。制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制氯霉素是蛋白质合成的抑制剂，一般在细菌生长的对数生长期后期剂，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达细菌达1109细胞细胞/mL)，加入氯，加入氯霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经过过1012小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中可达可达50%以上以上DNA是质粒是质粒DNA。严紧型严紧型(Stringent plasmid)和松驰型和松驰型(rel

8、axed plasmid)质粒质粒2021/3/108 PUC质粒都属松驰型质粒。质粒都属松驰型质粒。 PACYC184等质粒属严紧型质粒。等质粒属严紧型质粒。 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如如果插入外源果插入外源DNA较大较大,或其产量过高会产或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。2021/3/1092. 质粒的不相容性质粒的不相容性(incompatibility) 利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的利用同一复制系统不同质粒不

9、能稳定的和平共处的生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提取单一的取单一的DNA。2021/3/10103. 质粒的转移性质粒的转移性 革兰氏阴性细菌的质粒

10、分为接合型质粒革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒(Conjugative plasmid)，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。接合型质粒多属于严紧型质粒。接合型质粒多属于严紧型质粒。 非接合型质粒非接合型质粒(non-conjugative plasmid)也叫不能自我也叫不能自我转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非接合型质粒多属于松驰型质粒。接合型质粒多属于松驰型质粒。1）质粒的类型

11、）质粒的类型2021/3/1011 非接合型质粒的寄主细胞中同时存在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。又叫质粒的诱动。 2021/3/1012带有大肠杆菌素基因的带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。

12、如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以是一种可以迁移但属于非接合型质粒。迁移但属于非接合型质粒。2021/3/10132）F 因子因子 F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子(fertility facto

13、r)或性质粒或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有。它在寄主细胞中有三种存在方式：三种存在方式：独立于染色体之外，闭环双链独立于染色体之外，闭环双链DNA形式形式存在。这种细胞称存在。这种细胞称F+细胞。细胞。独立于染色体之外，闭环双独立于染色体之外，闭环双链链DNA形式存在，但其形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因上还携带有寄主菌染色体基因或或DNA区段。这种细胞称之为区段。这种细胞称之为F-细胞。细胞。以线性以线性DNA形式，形式，从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞细胞(高频重组细胞高频重组细胞)。 2

14、021/3/1014 F因子是雄性决定因子，因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形细胞表面可以形成一种叫做性须（成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使）的结果，它促使F+经性须进入经性须进入F-细胞。细胞。F-细胞则变为细胞则变为F+细胞。细胞。F因子可以通过接合作用自我转移，也能够因子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄主染色体一道转移。但带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种因子的这种整合过程是可逆的。在一定条件下，整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细细胞又可重新变为胞又可重新变为F+或或F-细胞。细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角

15、度考虑角度考虑 2021/3/1015人工质粒要素人工质粒要素1质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题）质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题）。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质粒大于粒大于15kb时，转化率将成为限制因素时，转化率将成为限制因素,质粒大，质粒大，拷贝数越低。拷贝数越低。2质粒应易于转化。质粒应易于转化。3质粒应有较多的拷贝数。质粒应有较多的拷贝数。4选择标记。选择标记。5质粒质粒DNA可插入可插入结合较大的外源结合较大的外源DNA。 2021/3/1016大肠杆菌质粒分子的结构示意图大肠杆菌质粒分子的结构示意图环形染色体环形染

16、色体DNADNA环形环形质粒分子质粒分子大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因控制控制质粒质粒DNADNA转移的基因转移的基因质粒质粒DNA2021/3/1017质粒主要包括几个组成部分质粒主要包括几个组成部分 复制子（复制子（reilcator） 复制起始位点复制起始位点(replication origin site) 多克隆位点（多克隆位点（Polylink）(MCS) 辅助序列辅助序列(COS位点等位点等) 选择标记选择标记(LacZ,抗性等抗性等)2021/3/10182021/3/1019pUC 18 和pUC 19质粒图谱2021/3/10202021/3/1021

17、2021/3/1022 质粒主要包括几个组成部分：质粒主要包括几个组成部分： 一、复制子（一、复制子（reilcator） 也就是基础复制子（也就是基础复制子（basic replicon），），具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位。一般约单位。一般约2kb，含一个复制起始部，含一个复制起始部位位Orgin（Ori）拷贝数）拷贝数多少多少和携带有和携带有控制复制的基因信息。控制复制的基因信息。2021/3/1023 复制起始位点复制起始位点(replication origin site) 是富是富 含含A, T区区,双链双链DNA在此在此 解鏈出现复制叉解

18、鏈出现复制叉.紧靠紧靠 富富 A, T区的侧面富区的侧面富G,C区区,组成回文结构组成回文结构,是是参与复制相关因子识别和结合位点参与复制相关因子识别和结合位点.2021/3/1024 具备有多克隆位点（具备有多克隆位点（Polylink）(MCS) 有数种限制性内切酶有数种限制性内切酶单一识别位点单一识别位点。便。便于插入外源于插入外源DNA片段，易组建重组质粒片段，易组建重组质粒而不影响质粒复制功能而不影响质粒复制功能 2021/3/1025 有多用途的辅助序列有多用途的辅助序列 如加入不同启动子序列，用于生产单链如加入不同启动子序列，用于生产单链DNA或或RNA，外源基因的大量表达。又，

19、外源基因的大量表达。又加入加入COS位点，使载体能容纳更大的位点，使载体能容纳更大的DNA片段等等。片段等等。 2021/3/1026 质粒载体的选择标记： 外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需要利用质粒载体的可选择标记。 2021/3/1027 质粒载体的选择标记质粒载体的选择标记 最常用，主要有：四环素最常用，主要有：四环素(Tet)、氨苄青霉素、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素、氯霉素(Cm)、卡、卡那霉素那霉素(Kan)、新霉素、新霉素(Neo)等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成Ampr，反之则写成，

20、反之则写成Amps。带有抗药性质粒称为。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源常有二种抗生素抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源DNA片段插入片段插入钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将外源外源DNA片段插入到会导致选择性基因片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等等)失活的位点。如失活的位点。如PACYC184质粒的质粒的EcoRI上插入外源上插入外源DNA片段，会导致氯霉素抗生基因失活片段，会导致氯霉素抗生基因失活(

21、Cms)。也有例外，如。也有例外，如Villa-Komaroff等等1978年发现鼠胰岛素年发现鼠胰岛素cDNA片段插片段插入入PstI切点，并未使切点，并未使Ampr基因失活。基因失活。 抗生素抗性基因选择标记抗生素抗性基因选择标记2021/3/1028 常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有：四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因 2021/3/1029 新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重组体： HA

22、Luaferase GFP 便于检测的多肽2021/3/1030原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸(fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒插入到质粒载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。丢失四环素抗性标记的正选择体系丢失四环素抗性标记的正选择体系2021/3/1031 四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停四环素抗菌

23、机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡。所以在含有四环新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡。所以在含有四环素培养基上，环丝氨酸只杀死素培养基上，环丝氨酸只杀死Tetr 细菌。对停止生长的细菌。对停止生长的 Tets 菌则无致死作用。若经过环丝氨酸法多次重复处理菌则无致死作用。若经过环丝氨酸法多次重复处理 Tets 菌会富集，产量上可高出数倍，便于筛选重组子。菌会富集，产量上可高出数

24、倍，便于筛选重组子。 环丝氨酸富集法筛环丝氨酸富集法筛Tets重组子重组子2021/3/1032环丝氨酸富集法示意图环丝氨酸富集法示意图AmpsTets非转化子非转化子AmprTetr转化子转化子(无插入片段无插入片段)AmprTets转化子转化子( 带插入片段带插入片段)转化混合物转化混合物氨苄青霉素选择氨苄青霉素选择四环素环丝氨酸选择四环素环丝氨酸选择2021/3/1033 通常用通常用互补现象的检查。很多质粒载体互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段都有一段(来自大肠来自大肠杆菌杆菌DNA)含含半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端的调控序列和该酶基因氨基

25、端146个氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不个氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶破坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了的重组子

26、则破坏了LacZ的的阅读框，不能使阅读框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近基因上缺失近操纵基因区段的突变体操纵基因区段的突变体(宿主菌宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的与带有完整的近操纵基因片段的-半乳半乳糖苷酶阴性的突变体糖苷酶阴性的突变体(质粒载体质粒载体)之间实现互补，这种互补现象称为之间实现互补，这种互补现象称为互互补。这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这补。这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这过程中还要加入过程中还要加入IPTG(异丙基硫化异丙基硫化-D-半乳糖苷半乳糖苷)作为酶反应

27、催化剂。作为酶反应催化剂。4. 显色法筛选重组子显色法筛选重组子2021/3/1034 质粒DNA有一段（来自大肠杆菌DNA）含半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，不破坏阅读框。宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物Xgal后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了Lac Z的阅读框，不能使Xgal变兰，而产生白色菌落。这种突变体（宿主菌）与质粒载体之间互补现象称为互补。入IPTG作为酶反应催化剂。20

28、21/3/1035 通过颜色变化筛选重组子。通常用互补现象的检查 互补原理互补原理:质粒的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的氨基端宿主菌的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的羧基端均无活性各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。5-嗅-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷（X-gal)蓝色产物蓝色产物-半乳糖苷酶异丙基硫代-D-半乳糖苷 （IPTG)蓝蓝-白斑实验白斑实验2021/3/10362021/3/1037 构建的质粒人工载体，应用最广的是构建的质粒人工载体，应用最广的是PBR322，分子量为，分子量为2.6106，含，含46332bp。含有

29、选择标记抗氨苄青霉素。含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr r）基因来自天然质粒）基因来自天然质粒RSF2124和抗和抗四环素（四环素（Ter r）基因来自）基因来自PSC101质粒。质粒。复制子部分来自复制子部分来自PMB9（一类（一类Co1E1质质粒）。多克隆限制性内节切酶位点有粒）。多克隆限制性内节切酶位点有9个个 2021/3/10382021/3/1039 在PBR322的基础上已构建出第二代，第三代质粒载体衍生物。PUC系列，Pbluescript质粒，体积更小，具有更多的单一限制性内切酶位点，其拷贝数也比PBR322多1020倍。可获得更多的DNA产量。 2021/3/1040202

30、1/3/1041 质粒的消除质粒的消除 有的质粒在自然条件下可以从宿主菌中有的质粒在自然条件下可以从宿主菌中消失。也可以在培养细菌时加入适当的消失。也可以在培养细菌时加入适当的理化因素使质粒消除（理化因素使质粒消除（curing）。）。 质粒的消除剂有：吖啶橙，溴化乙锭，质粒的消除剂有：吖啶橙，溴化乙锭，利福平，利福平，SDS，紫外线，高温等。，紫外线，高温等。2021/3/1042不同载体的用途不尽相同：不同载体的用途不尽相同：1）克隆、扩增外源基因）克隆、扩增外源基因(片段大小片段大小)：质粒用于常规：质粒用于常规DNA克隆。克隆。COSmid和和噬菌体用于染色体，大的噬菌体用于染色体，大

31、的DNA片段克片段克隆。隆。2）外源）外源DNA或或cDNA在载体上进行改造、缺失、重组一在载体上进行改造、缺失、重组一般用质粒。般用质粒。3）序列分析：）序列分析：dsDNA或或ssDNA测序，用质粒或测序，用质粒或M13以及以及一些新型质粒。一些新型质粒。4）制备探针：单链）制备探针：单链DNA或或RNA利用质粒，制各单链利用质粒，制各单链DNA探针利用探针利用M13。5）表达原核基因的载体：质粒，入噬菌体）表达原核基因的载体：质粒，入噬菌体(表呈技术表呈技术)2021/3/10436）表达真核基因载体）表达真核基因载体(包括病毒疫苗研制包括病毒疫苗研制)：质粒、酵母、：质粒、酵母、病毒病

32、毒7）转移载体：将外源基因转入哺乳动物细胞中，建立）转移载体：将外源基因转入哺乳动物细胞中，建立稳定表达基因的细胞株，常用质粒和病毒载体。稳定表达基因的细胞株，常用质粒和病毒载体。8）PCR产物克隆载体：产物克隆载体：T载体、载体、Teasy载体、载体、PCR等。等。9）DNA疫苗载体疫苗载体10）研究基因结构功能的载体，如无启动子载体。）研究基因结构功能的载体，如无启动子载体。2021/3/1044 载体如何选择：载体如何选择： 1根据插入片段大小，及酶切位点。根据插入片段大小，及酶切位点。 2重组体的目的、作用（文库、表重组体的目的、作用（文库、表达、基因调控、探针、突变）。达、基因调控、

33、探针、突变）。 3筛选方便（探针、免疫学方法、筛选方便（探针、免疫学方法、抗性、显色）。抗性、显色）。 4便于提纯（加入便于提纯（加入His、生物学、生物学 、牛血清血蛋白牛血清血蛋白BSA）。）。 不同载体用途不尽相同不同载体用途不尽相同2021/3/1045 一一、克隆、扩增外源基因（片段大小）克隆、扩增外源基因（片段大小） 质粒用于常规质粒用于常规DNA克隆。克隆。COSmid和入和入噬 菌 体噬 菌 体 , 细 菌 人 工 染 色 体细 菌 人 工 染 色 体.酵母人工染色体酵母人工染色体,用于染色体，大的用于染色体，大的DNA片片段克隆。段克隆。2021/3/1046 二二、外源、外源DNA或或CDNA在载体上进行改造、缺在载体上进行改造、缺失、重组一般用质粒。失、重组一般用质粒。 三三、序列分析、序列分析 dsDNA或或ssDNA测序，用质粒或测序，用质粒或M13以及一些以及一些新型质粒。新型质粒。 四四、制备探针、制备探针 单链单链DNA或或RNA利用质粒，制各单链利用质粒，制各单链D