乙型肝炎的现状及疫苗研究进展

1、乙型肝炎的现状及疫苗研究进展院（系、所）:专 业：姓 名: 学 号：完 成 日 期：摘要：慢性乙肝的研究正趋于完善化，成熟化。其疫苗的研制正处于关键时期。疫苗的研制更加的多样化。关键字：难治愈 待研究 多途径一、 慢性乙型肝炎的现状和问题慢性乙型肝炎是一种世界性流行的传染病全球乙型肝炎病毒(HBV)感染者约为 3.5亿人我国是HBV感染的高流行地区最近,根据2002年的全国HBV感染者血清流行病学调查，HBsAg流行率为9091 约12亿人。其中慢性乙型肝炎病人约为2000万3000万。5年的自然史约lO20慢性乙肝可发 展为肝硬化2023肝硬化可发展为失代偿期肝硬化，615可发展为 肝细胞性

2、肝癌(HCC)。而5年存活率代偿期肝硬化为55失代偿期肝硬化为 14。每年死于乙肝相关性肝病约为3O万人。此外，HBV携带者的母亲可以通过垂直传播使婴儿受染婴JLR,1-期感染HBV者90以上成为慢性HBV携带 者，随着年龄的增长可反复发作肝炎演变为慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和HCC。因此HBV危害极大成为重大的公共卫生问题。在2005年慢性乙型肝类与艾滋病、结核病和血吸虫病一同被定为我国四大重点防治的传染病目前研究证明持续高HBV载量是慢性乙肝病情进展的主要病因通过对26个前瞻性研究荟萃分析显示血清HBV DNA水平与肝组织病变严重程度及活动性呈正相关。经抗病毒治疗后，随着HBV DNA水平下

3、降肝病活动指数(HAI)也下降因此慢性乙型肝炎患者病毒载量可以衡量其组织病变的严重程度。台湾学者证 明持续高HBV DNA水平，发生肝硬化和HCC的病人明显增加。因此，对慢性乙 型肝炎主要的治疗应该是最大限度地持久抑制病毒或清除病毒2-4 国内外对慢性乙型肝炎治疗目标的共识是长期、持续抑制和消除HBV从而减轻和防止肝炎病变加重、复发和肝纤维化减少和预防其进展为肝脏失代偿、肝硬化和HCC以提高生活质量和生存期5-7慢性乙型肝炎是一种难治性疾病治疗困难的原因主要有：目前抗HBV药物只 能抑制病毒复制很难消除HBV；由于HBV CCC DNA半衰期较长目前所有抗 病毒药都不能将清除是HBV复制及复发

4、的原因：慢性乙型肝炎患者存在不同 程度的免疫耐受和免疫功能低下很难免疫清除HBV；病毒易发生耐药变异，引起对抗病毒药耐药；HBV DNA与宿主细胞染色体的DNA整合。但目前认为主要因素:一是HBV复的原始模板HBV CCC DNA半衰期长，不易降解。目前的抗病毒药不能消除HBV CCC DNAHBV CCC DNA成为HBV在体内持续复制和抗病毒治疗复发的主要原因：另一个因素是患者存在不同程度对HBV的免疫耐受(immune tolerance)和免疫功能低下，使HBV不易被免疫清除。长期甚至终身在体内存在及复制慢性乙型肝炎应采用综合治疗方法:抗病毒、免疫调节、消炎、改善肝功能和抗肝纤维化治疗

5、。而抗病毒是主要和关键治疗目前认为清除HBVcccDNA有2 种策略：通过有效长期抗HBV药治疗,可长期、明显抑制HBV外源性感染和内源性复制。可持续减少和阻断对HBVCCCDNA库的补充，最后达到使其耗竭的目 的。因此。必须强调长期、有效的抗HBV治疗。 打破免疫耐受，提高特异性免 疫功能消除免疫耐受提高人体免疫功能尤其是特异性细胞免疫功能通过 细胞溶解机制和非细胞溶解机制,消除细胞内,外的HBV,包括HBVcccDNA。是根 治HBV关键的治疗措施。但由于免疫耐受的机制迄今尚不清楚目前尚无有效免疫治疗方法。各种治疗性疫苗尚在研究中。研究HBV感染的免疫耐受机制和治 疗是治疗HBV感染的根本

6、措施应加强研究。其次，采用长期有效的抗病毒治 疗。近年来，高效、低毒的抗HBV药不断增多为有效治疗慢性乙型肝炎创造条 件。单一抗病毒药如仅干扰素尤其是聚乙二醇化干扰素apeg IFNct干扰素疗效优于普通干扰素，每周注1次使用方便，因其有免疫调节作用易获得 持续疗效不产生耐药性，但不良反应较多、较大，不宜用于肝脏失代偿病人。新的核苷类似物不断出现抗HBV疗效快而强适应证较广，不良反应少可以口 服，使用方便。但需长期治疗停药后易出现病情恶化长期治疗易发生病毒耐 药突变可产生耐药而使病情反弹。近年来，国内外学者采用以下治疗方法：联合治疗：到目前为止尚无肯定有效的联合治疗方法。但联合抗HBV不同作用

7、 靶位和机制的药物可能会产生抗HBV的协同作用。但选用何种药物联合，如何 联合，其耐药性和不良反应等尚需一步研究。联合治疗药费较贵 是否符合药物经济学原则，有待进一步研究。序贯治疗：是有效的抗HBV药连续、交 替和顺序使用可以长期、有效地HBV防止病毒耐药突变和减少药物不良反 应。尤其是新的有效抗HBV药不断研制和临床应用为序贯治疗创造更多可供选 择的有效药物和良好的治疗条件 。符合长期有效抗HBV治疗的原则。但应选择 哪些有效的抗HBV药物如何进行有效的序贯治疗等，还需进一步研究。个体 治疗：根据病毒的特点(如HBV的基因型、病毒变异情况等)和病人的个体因素(如 年龄、肥胖和免疫状态等)对抗

8、HBV治疗的应答及耐受性等。个体治疗是减少抗HBV治疗个体差异提高抗HBV疗效的有效治疗方法。但影响因素很多而且复 杂尚需进一步研究。慢性乙型肝炎是一种难治性疾病。目前要清除HBV，达到 治愈疾病的目标，还有很大的难度，很多问题还有待于研究和解决 。如何打破 病 人的免疫耐受，如何清除HBV CCC DNA，怎样长期、有效抗病毒治疗和如何监测并防治病毒的耐药突变等都有待进一步的研究和解决。二、乙型肝炎治疗性疫苗研究现状治疗性疫苗的概况:广义的治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某 些疾病的机体中，通过诱生特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、 人工合成或用基因重组技术表达的产品或

9、制品8。早在100 年前，巴斯德已经开 始采用治疗性疫苗，他用狂犬疫苗预防已被狂犬咬伤但尚未发病的患者，防止发 生致死性狂犬病。近年来 ,在新现和再现传染病的不断出现、微生物持续感染日益增多以及微生物耐药问题日趋严重的情况下，治疗性疫苗重新被重视并已开 展了大量的基础性和应用性研究。根据针对疾病的种类不同可将治疗性疫苗分 为：细菌类治疗性疫苗；病毒类治疗性疫苗；肿瘤类治疗性疫苗和自身免疫类治 疗性疫苗。根据其作用机制的不同又可分为非特异性和特异性治疗性疫苗。卡介 苗是一种非特异性疫苗，能激活和加强多种免疫细胞的功能，如激活巨噬细胞， 加强T、B细胞的功能，促进自然杀伤(NK)细胞杀瘤活性，促进

10、造血干细胞生成 等，从而起到免疫增强作用。卡介苗可以引起某些肿瘤细胞坏死 ，阻止肿瘤转 移，消除机体对肿瘤抗原的耐受性，所以可作为某些癌症的辅助治疗用药。对于 大多数特异性治疗性疫苗的作用机理还尚不明了。目前一般认为其不同于患者 体内的微生物抗原，通常由大剂量高度纯化的微生物抗原和能提高免疫功能的 其它成分组成，抗原量大，免疫原性强，加以佐剂对免疫系统有较强的刺激作用， 并可通过不同途径把微生物抗原提呈给免疫系统，能够更效地诱导液和细胞免疫 应答且可消除免疫耐受【9】。治疗性疫苗和预防性疫苗不同，预防性疫苗的接种对象是健康群体，一般均可用于易感人群，免疫应答往往低于正常水平。它主要起到免疫预防

11、的作用，对机体一般不会造成病理性损伤，因而较为安全。免疫效果可通过客观指标来评价，方法较成熟。治疗性疫苗的使用对象是持续性感染的个体，机体的免疫应答水平常较低下，使用时有一定的副作用，常伴有不同程度的免疫损伤。其组成成分一般不像预防性疫苗那样单纯，可根据需要进行调整 ，以便打破免疫耐受，提高对病原体的特异性免疫反应，最终达到治疗的目的。因而更加强调佐剂的选用、接种途径和接种次数的优化、疫苗的联合应用以及新免疫制剂的开发【10。11】。慢性乙型肝炎免疫发病机制的相关进展研究表明急性乙型肝炎患者体内针对病毒的免疫应答较强且是多克隆多特异性的，而在慢性乙型肝炎患者体内的免 疫应答较弱且是单克隆和特异

12、性的【12】 ，所有的慢性感染病人，既便是成年人感 染，免疫功能正常，HBV特异性T细胞应答也较弱、范围局限【13】。人们提出了一些HBV持续感染的可能机制：一是T细胞应答数量和质量上的不足，使HBV复制和表达部分下调，可能降低抗原提呈效率使感染细胞逃避免疫识别。T细胞的效 应功能能遵循一定的等级：低抗原肽浓度和较弱的T细胞受体激动剂可以诱导C D8+T细胞的细胞毒作用，而INF一7的产量和对IL-2的反应性需要高抗原肽浓 度，而且T细胞的增殖也需要高水平的刺激14。二是若接种量和感染动力学适宜 于HBV复制，而诱导的宿主免疫应答较弱，则HBV可能跨越宿主的防线15，迅速感染肝细胞并到达肝外H

13、BV特异性T细胞不易进入的部位 。三是病毒可能通过 T细胞识别位点的变异而逃避免疫应答16Mairfi等【17】用体外扩增T细胞结合人类白细胞抗原一肽一四聚体直接计数人外 周血及肝内浸润的HBV特异性CD8 细胞的数目，发现肝脏无病理性损伤和HBV复制的患者同肝脏内有T细胞浸润并出现病变的患者相比较，HBV特异性CD8细胞的绝对数相似，但前者所占比例相对较低而后者较高。提示造成肝组织损伤的不是HBV特异性CD8细胞，因而不仅需要研究CD8 T细胞的数目，还需要研究其功能，尤其是要明确CD8 细胞是否为HBV特异性CD8 细胞。在病毒抗原滴度高的慢性乙型肝炎患者中，存在一定数量的“非典型耐受”C

14、D细胞。有意义的是这种特异性的改变仅限于针对HBsAgE”【18】，说明调节HBV感染者的免疫应答应主要针对HBsAg。树突状细胞(dendritic cells，DC)在抗原提呈中的重要性受到重视。既往的研究提示在特异性免疫治疗前先上调DC功能可获得更好的治疗效果。为改善抗原 提呈细胞不能有效的提呈抗原并激活CD4、0)8和细胞免疫的状况，等 【19】以逆 转录病毒载体作基因修饰使鼠DC分泌HBc与IgGFc段的融合蛋白，通过Fc受体介导，使抗原可通过DC主要组织相容性复合物I途径呈递抗原直接激活细胞 毒性T淋巴细胞，诱生针对乙型肝炎核心抗原的免疫应答，其效果可增强约100 0倍。NKT细胞

15、既表达NK细胞的表面标志又表达T细胞的表面标志，以及少量的T细胞受体，是机体先天性免疫应答体系的重要组分NKT细胞能介导直接细胞毒作 用，快速产生大量II 和IFN一7， 并影响抗原特异性细胞的启动。在试验条件 下用增乳糖脂酰硝氨(Galcer)一种CDld分子提呈的非肽抗原注射HBV转基因 鼠体内，活化NKT细胞产生IFN一7，从而下调HBV的复制水【20，21】，这种效应通过 IFN一7依赖的NK细胞的募集与活化得到放大。NKT细胞的另一亚群也是CD1d限制性的 ，但是表达不同的T细胞受体，不能识别aCalCer。有趣的是，当将起转导入免疫缺陷的HBV转基因小鼠体内后，这一亚群细胞自发活化

16、并导致 急性肝炎【22】。因此提示NKT细胞在HBV 感染的早期宿主应答中具有一定的作用 。三几类治疗性乙肝疫苗(一)核酸疫苗2o世纪90年代初，一系列关于注射外源基因在体内诱导免疫应答的研究成果揭开了核酸疫苗的序幕【23】，该疫苗和常规疫苗相比具有制备简单、 接种基因可在体内少量持续表达、免疫力持久、基因疫苗产生的抗原接近自然状态、性状稳定和诱导CTL细胞最有效等优点。人们已经进行了用HBV基因组的不同开放读码区制备核酸疫苗的研究。Mancini等 24 驯用编码HBsAg和preS2区段的基因免疫HBsAg转基因小鼠，发 现循环HBsAg被完全清除且HBsAg基因表达受到长期抑制。提示T细

17、胞是下调肝 内HBV mRNA水平的主要因素。第一次表明了DNA免疫在感染性疾病免疫治疗中具有巨大的应用前。Tiolais等25用编码LHBsAg的质粒进DNA免疫，结果部分动物在一次接种质粒4周后也完全清除HBSAg。认为用核酸疫苗进行免疫治疗诱 导有效的细胞和体液免疫应答在介导慢性HBV感染者清除体内病毒的过程中具有十分重要的意义26 由于HBV的核心抗原对于不同的病毒亚型是高度保守的，且在急性自限性和慢性 肝炎中HBcAg是CD4 T细胞应答中最活跃的HBV蛋白，因而认为它是较理想的免疫治疗靶位。Townsend等27表达HBcAg和新霉 (HBcNEO)磷酸转移酶的重组逆转录病毒载体肌

18、肉注射小鼠和恒河猴均诱导出了HBcAg特异性的抗体和CD4 CD8 T细胞应答。用非复制性的表达HBcNEO融合蛋白的逆转录病毒载体颗 粒接种3只慢性感染的黑猩猩后，一只发生了典型的血清学转换，另两只表现为一过性的ALT升高和血清HBV DNA水平的显著下降 28。另外，HBcAg特异性CIM 细胞还可以辅助B细胞产生抗HBsAg中和抗体29，这些都表明慢性HBV感染的治疗性免疫应包括HBcAg 。HBV多聚酶尽管比其它抗原产量要小得多，在急性自限性肝炎中它是一种高免疫 原性CD8 T细胞表位。由于在HBV生活周围的早期阶段多聚酶是必需的，因而识 别这种抗原将限制HBV的扩散，减轻疾病的程度。

19、Kalimi等30研究发现编码多聚酶的质粒可以打破免疫耐受并诱导特异性的CD8 T细胞，而包膜蛋白则不行。然而HBV多聚酶特异性CD8 T细胞既不能抑制HBV的复制， 也不能诱导肝脏疾 病。过继转移试验显示多聚酶特异性CD8 T细胞的确归巢进入肝脏，体外再次暴 露于特异性抗原时也行使效应功能。但要在HBV转基因鼠中发挥抗病毒作用需要过继转移比包膜蛋白特异性CD8 T细胞多l5倍以上的多聚酶特异性CD8 T细胞。这些研究提示，低亲和力的多聚酶特异T细胞和或肝细胞内多聚酶抗原的低产 量是体内过继转移多聚酶特异性T细胞功能较弱的原因。可见在免疫治疗中免疫 原性最强的抗原不一定是最适合的，因为体内适当

20、的效应功能还依赖于其诱导的 T细胞具有足够高的亲和力，以及HBV感染肝细胞表面靶抗原的水平足够高。多项研究证实将编码某些细胞因子(IL-2、IL-12、GMCSF等)或共刺激分子(B 71、B72 等 )的序列同编码HBV抗原的核酸疫苗重组可以获得更强的细胞和体液免疫应答。以HBc、HBs等作为类病毒颗粒载体而制备的核酸疫苗，由于类病毒颗粒载体的特殊性可以使插入表位以适宜的空间构像和密度展示在颗粒的表面，从而更有利于激发有效的体液和细胞免疫应答，因此可能成为极具前景的核酸疫苗载体31。32(二)乙型肝炎病毒表面抗原-抗体复合物 闻玉梅等33 在l4例慢性乙型肝炎患者应用血源性HBsAg一乙型肝

21、炎免疫球蛋白复合物治疗性疫苗的结果显示，9 名患者的血清HBV DNA阴转，6名HBsAg阴转，2名出现抗 H B e，但患者血清HBs舷无变化。改用酵母菌表达的重组HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白治疗性疫苗， 现已进入I期临床研究。目前研究认为其机制为：HBV表面抗原一抗体复合物通 过同抗原呈递细胞表面的Fc段受体结合增加HBsAg的摄入并调节HBsAg的处理 和提呈，从而激发T细胞应答，增加IL-2和TNF-的产量。当联合使用重组质粒和免疫复合物时发现抗-HBs滴度较单独使用重组质粒或免疫复合物显著增 高。由于DNA疫苗既可以引起细胞免疫应答又可诱导体液免疫反应，所以联合应 用DNA和HBV

22、表面抗原-抗体复合物有望成为另一种乙型肝炎的治疗性疫苗34。35(三)细胞因子 尽管人们已经认识到细胞因子在病毒清除和调节机体抗病毒免疫反应中的重要作用，但系统性应用细胞因子会引起严重的副作用，因而限制了其在抗病毒治疗中的应用。细胞因子的靶向治疗和定向表达是目前研究的重要 方向。Eto等 36使用唾液酸糖蛋白受体化的IFN，收到了较人类天然IFN更佳的抗病毒效果。Tong等37应用抗- HBs和IFN的活性融合蛋白也取得了良好的疗 效。Protzer等构建了含有鸭源性tENEt编码序列的重组DHBV，体内重叠感染DHBV阳性的肝细胞，较使用IFN组DHBV的产生量明显降低，且具有剂量依赖性 3

23、8。其它一些免疫调节性细胞因子，如：IL-12、IFNa、TNFEt等经证实在HBV转基因小鼠中也具有一定的抑制病毒复制的作用，然而IL-12和Thl型细胞因子 IFNEt、IL-12在HBV慢性感染者清除病毒过程中似乎起到更重要的作用39 。Lee等 40构建了一个前IL-12载体，它含有两个CMV启动子，分别加强表达P35和P40亚基，同时还构建了pseIL-12载体，将P35cDNA和P40 cDNA融合连接以产 生一个单链IL-12蛋白。将pselG12转染COS细胞系和C2C12细胞系，发现pII， l2 高水平产生具有生物活性的IL-12。而当用编码裸IL-12或单链IL-l2融合

24、 蛋白与表达HBV主要核壳蛋白的pS载体共免疫小鼠时，小鼠体内产生了高水平 的抗HBs Ig G2a 抗体和Thl细胞相关的细胞因子。由于 P35和P40基因能用一个简单的启动子在一个载体中表达，所以psclL-12在慢性炎的免疫治疗中具 有很好的应用潜力。目前有关细胞因子抗病毒治疗作用的研究尚处于试验阶段 ， 还需要进行大量的研究。(四)其它有报道显示将编码相关抗体的基因导入细胞表达后可以结合相关抗 原成分而干扰靶细胞的功能。研究表明针对HBsAg抗体的Fv段细胞内表达可使细胞外HBsAg水平下降85左右41。抗一HBcsFc与HBcAg形成细胞内复合物也可有效地抑制病毒复制 42，抗多聚酶

25、的单克隆抗体也可观察到相似的效果43 HBV核衣壳是病毒基因组复制的场所，因而是免疫治疗较理想的靶点。已证实负显性(DN)核心蛋白变异可以干扰核衣壳的装 配。Weizsacker等分别将DHBV pol、DHBV S 、lac z和GF P融合连接于DHBV核心蛋白的C末端以产生DNA变异株来抑制LMH细胞系内病毒的复制。结果发现Core-pol和Core-S明显地抑制了前基因组的包装：Core-GFP同野生性核心蛋白形成了混合颗粒干扰了前基因组 的逆转录过程44 。表明至少有两上过程，即前基因组的包装和逆转录过程 ，可作 为治疗的靶点。另一种更有效的方法是衣壳靶向的病毒灭活，好以病毒衣壳或其

26、它病毒相关蛋白为载体将降解酶特异性地引入到病毒内。Beterams和Nassal发现将钙离子依赖性的核酶(SN)融合于核心蛋白的C末端共转染人肝癌细胞系， 不足野生型核心颗粒数目110的coreSN蛋白就使带包膜含DNA的病毒子减95 ，且进一步研究证明coreSN并没有细胞毒性【45】。四、治疗性疫苗研究展望虽然近十余年来有关乙型肝炎治疗性疫苗的研究有了长足的进展，但目前治疗性疫苗的疗效尚不十分稳定，疗效也较有限，安全性问题也是人们关注的焦点。必须认识到治疗性疫 苗的开发还需要进行大量和长期 的工作，疫苗疗法并不能取代药物治疗，应当根据患者机体的免疫状况，选择适 当的时机使用治疗性疫苗。相信

27、随着对HBV生物学，尤其是其复制机理以及分子 生物学、免疫学等认识的加深，会有越来越多的治疗靶位被发 现，人类一定能够找到理想的治疗性乙肝疫苗，从而达到有效治疗乙型肝炎的目的。 参考文献1梁晓峰，陈园生，王晓军，等 中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究中华流行病学杂志，2005，2 6：6556582Mommeja-Marin H ，Mondon E ，Blum R M et a1 Serum HBV DNA as a mark -er of efficacy during therapy for chronic HBV infection ：Analysis and rev -iew o

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