反向遗传学及其相关技术精编版

1、一、概述一、概述（一）遗传研究的二条途径（一）遗传研究的二条途径1、表、表里：里：正向遗传学研究正向遗传学研究杂交或诱变杂交或诱变表型观察表型观察遗传规律遗传规律确定存在确定存在的基因及数目的基因及数目基因的功能及作用性质。基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。遗传学采用的研究方法。2、里里表：表：反向遗传学研究反向遗传学研究在已知在已知DNA序列的基础上，通过序列的基础上，通过DNA重组、重组、定点突变、插入定点突变、插入/缺失

2、等缺失等遗传修饰遗传修饰手段创造突手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。学技术。（二）（二）RNA病毒的反向遗传学病毒的反向遗传学 n 采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。新拯救出活病毒或类似病毒物质。 n 能够拯救病毒的遗传材料称为能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆感染性克隆，一般是，

3、一般是在在细菌质粒中含有整个病毒基因组的细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝拷贝，使得使得cDNA本身或从本身或从cDNA体外转录所得的体外转录所得的RNA具具有感染性。有感染性。 n RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能有效地研究病毒基因结构、功能和病毒和病毒-宿主相互作用。宿主相互作用。 nRNA病毒的反向遗传操作病毒的反向遗传操作 RT-PCR构建构建RNA病毒的全长病毒的全长cDNA，并

4、进行遗传修饰，并进行遗传修饰 与与RNA聚合酶启动子结合聚合酶启动子结合 体外转录病毒体外转录病毒RNA 转录物转录物RNA感染哺乳动物细胞感染哺乳动物细胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型变化拯救病毒的表型变化 病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒基因组的表达、调控、致病机理、 病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等单正股单正股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶+mRNA + +中间型中间型 结构蛋白结构蛋白+子代正股子代正股RNA单负股单负股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶 +结构蛋白结构蛋白子代负股子代负股RNA逆转录病毒逆转录病毒：RNARNA/D

5、NA中间体中间体逆转录酶逆转录酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA与负股与负股RNA病毒、逆转录病毒病毒、逆转录病毒?（三）真核生物的反向遗传学（三）真核生物的反向遗传学采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。能基因组学的主要内容。研究手段包括基因的互补实验、超表达、反研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。

6、研究基因功能是主要的反向遗传学技术。二、反向遗传学相关技术二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组、基因的同源重组2、基因的位点突变、基因的位点突变3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除利用利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改

7、变，达到研究基因功能的目的。遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组、基因的同源重组 完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除。细胞或者动物个体中的活性完全消除。 条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段。类型的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除完全敲除条件敲除条件敲除特定组织特定组织/时间基因敲除时间基因敲除基因敲除基因敲除1）通过同源重组的基因敲除步骤）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体构建重组载体 重组重组DNA转入受体转入受体细胞核内细胞核

8、内 筛选目的细胞筛选目的细胞 转基因生物转基因生物重组载体的类型：重组载体的类型：a)替换性载体系统：替换性载体系统：包括同源序列片段、替包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道换基因的启动子、报道基因等成分。基因等成分。b)插入性载体系统：插入性载体系统：插入基因片段插入基因片段(目的基目的基因因)、同源序列片段、同源序列片段、标志基因片段。标志基因片段。用替换型（用替换型（a）或插入型（）或插入型（b）载体进行完全基因敲）载体进行完全基因敲除实验除实验2）Res同源重组系同源重组系统统源于源于噬菌体噬菌体Res重组酶的重组系重组酶的重组系统统Ha 和和Hb: 同源重组区域同源重组区域 Pa

9、 和和Pb: 引物位点引物位点sm: 筛选标记筛选标记Red 同源重组技术用于基因打靶同源重组技术用于基因打靶3）Cre-LoxP同源重组系统同源重组系统 源自源自P1噬菌体的重组系统噬菌体的重组系统 属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。该系统由该系统由P1噬菌体的噬菌体的Cre重组酶和重组酶和LoxP位点两部位点两部分组成。分组成。nCre重组酶：重组酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介导介导两个两个LoxPLoxP位点（序列）之间的特异性重组，使位点（序列）之间的特异性重组，使LoxPLoxP位点间的基因序列被删除或重组。位点间

10、的基因序列被删除或重组。n LoxP位点：位点：由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重组酶重组酶13bp的反向重复序列的反向重复序列 Cre-LoxP 重组系统的特点重组系统的特点 Cre 重组酶所催化的是一个可逆的重组事件重组酶所催化的是一个可逆的重组事件 Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与催化重组不需要任何辅助因子的参与l 介导两个同向介导两个同向LoxP位点之间序列的插入位点之间序列的插入/缺失（下左）缺失（下左） 介导两个反向介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）位点之间序列颠倒（下右） 介导两条含介导两条含Lox

11、P位点位点DNA链的交换或染色体易位。链的交换或染色体易位。 Cre-Loxp gene knock-out system模式动物小模式动物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系，白近交系，白色，易产生色，易产生免疫缺陷免疫缺陷 2、基因的位点突变、基因的位点突变1）点突变）点突变TILLING技术技术TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向诱导基因组局部突变定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱变，是一种快速有效地从由化学诱变剂剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。诱变过的突变群体中鉴

12、定出点突变的方法。 先用化学诱变剂先用化学诱变剂(甲基磺酸乙酯，甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生诱发产生一系列的一系列的点突变点突变，再用设计的特异性引物进行，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，然后将扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶凝胶(PAGE)电泳检测分析。电泳检测分析。（建池）（建池）TILLING特点：特点： TILLING技术属于高频率点突变和技术属于高频率点突变和PCR筛选相结筛选相

13、结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。损伤等突变类型。u可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因，可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因，复等位基因等具有独特的技术优势。复等位基因等具有独特的技术优势。u可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体。较小的突变群体。u不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养。耗时的转基因和复杂的组织培养。u需要知道所研究基因的序列。需要知道所研究基因的序列。2）随机插入突

14、变）随机插入突变T-DNA插入突变插入突变 以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。并鉴定其功能。构建构建T-DNA载体载体转化转化突变体的筛选及遗传分突变体的筛选及遗传分析析分离分离T-DNA 插入位点的侧翼序列插入位点的侧翼序列基因的基因的定位、结构与功能分析。定位、结构与功能分析。T-DNA法敲除植物基因法敲除植物基因及突变体筛选：及突变体筛选： a.引物设计。引物

15、设计。LP和和RP分别代表插入基因两端的引分别代表插入基因两端的引物，物，LB是指载体上的一段是指载体上的一段 引物。旁邻序列是经测序后引物。旁邻序列是经测序后获得的获得的DNA序列。序列。 b. PCR产物电泳结果。产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和分别代表野生型、杂合子和纯合子纯合子PCR条带。条带。T-DNA插入特点：插入特点：n 不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。插入来敲除一个特定基因仍需要运气。n 隐性突变与显性突变：隐性隐性突变与显性突变：隐性表型的变化只能在表型的变化只

16、能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性性可以在转化体中直接观察到（基因激活）。可以在转化体中直接观察到（基因激活）。n 某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。冗余基因。n 染色体重排：突变体表型与染色体重排：突变体表型与T-DNA 插入无关。插入无关。n 效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。 转座子插入突变转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子

17、，在目标细胞利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。应的基因敲除细胞。由转座子引起的突变可以转座子由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突变为探针，从突变体的基因组体的基因组DNA文库中筛选到突变的基因，再利用这文库中筛选到突变的基因，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而

18、的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。得到完整的基因信息。转座子插入特点：转座子插入特点： 插入的是完整的元件，便于分析。插入的是完整的元件，便于分析。 可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。验证突变基因的功能。 转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构。究基因组某一局部区域的结构。 通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化通过不断跳动产生新的突变

19、，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。工作量。可以应用于转化效率不高的植物。可以应用于转化效率不高的植物。转座子系统转座子系统 Ac/ Ds 系统系统 由自主性元件（由自主性元件（Ac）和非自主性元件（）和非自主性元件（Ds）构成。构成。Ds元件能够在元件能够在Ac编码的转座酶的作用下编码的转座酶的作用下移动，去除移动，去除Ac元件可使其自身不能转座。元件可使其自身不能转座。I. 通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序列可以重新移动。因此，列可以重新移动。因此，Ac/Ds 转

20、座子插入系统转座子插入系统只需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座只需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座源即可。源即可。在真核系统中，转座插入事件常不能产生可在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。服这些困难。修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座获得，这样就可以通过报告基因来检

21、测转座子的表达情况。子的表达情况。修饰的修饰的Ac/Ds转座子系统转座子系统n增强子陷阱增强子陷阱( enhancer trap )：转座子含：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。近时才能获得。n启动子陷阱启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。时才能表达。修饰的方法修饰的

22、方法-增强子陷阱与启动子陷阱增强子陷阱与启动子陷阱 Mu转座子系统转座子系统n 转座子打靶载体是以两种噬菌体转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的为基础的mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。转座子，每个转座子上都携带标记基因。n 可以在拟删除基因两侧各插入一个可以在拟删除基因两侧各插入一个mini-Mu转座转座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。子，然后在两个插入位点之间制造缺失。n 这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移。基因转移。n 特点：特点：u 不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可不需要知道基因组序列，仅已知外显子

23、即可u 载体构建迅速，技术简单载体构建迅速，技术简单u 载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。多基因。三、基因沉默技术三、基因沉默技术q 反义反义RNAq RNA干扰干扰（RNAi） 反义反义RNA技术技术反义反义RNA技术是根据技术是根据RNA序列人工合成的互补序列人工合成的互补RNA。根据反义。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：的作用机制可将其分为三类：1、反义、反义RNA是直接作用于靶是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位点的核蛋白体结合位点或与靶或与靶mRNA直接结合形成双链直接结合形成双链RNA，从而直接抑制，从而直接抑制m

24、RNA的翻译或被的翻译或被RNA酶酶识别降解。识别降解。2、反义、反义RNA是与是与mRNA的非编码区结合，引起的非编码区结合，引起mRNA构构象的变化，从而抑制其翻译。象的变化，从而抑制其翻译。3、反义、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。的转录。RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi)与靶基因序列同源的双链与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的所诱导的一种序列特异性转录后一种序列特异性转录后基因沉默基因沉默现象。现象。 RNA干扰干扰基因沉默基因沉默转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默(Transcriptional

25、Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)基因沉默基因沉默转录水平的基因沉默（转录水平的基因沉默（TGSTGS）是指基因在细胞核内是指基因在细胞核内RNARNA合成受到了阻止而导致基因沉默。合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。 引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： 基因及其启动子甲基化基因及其启动子甲基

26、化：通常发生在通常发生在DNADNA的的CGCG序列的碱基上，序列的碱基上，该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。 同源基因间的反式失活同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他拥有同源序列的沉默位点和其他位点的位点的DNADNA的相互作用而引起的基因沉默的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的甲基化并失活的基因能作为一种基因能作为一种“沉默子沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位

27、基导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。因，也可以是非等位基因。 后成修饰作用导致的基因沉默后成修饰作用导致的基因沉默：指转基因的序列和碱基组指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 重

28、复序列重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。制其表达。 转录后水平基因沉默转录后水平基因沉默（PTGSPTGS）则是指基因能够在细胞则

29、是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNAmRNA存存在的现象。在的现象。 引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种： 共抑制共抑制：由由NapoliNapoli在转在转CHSCHS基因的矮牵牛花中发现，普基因的矮牵牛花中发现，普遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。源基因的表达同时受到抑制。 具有同源性的外基因和内

30、源基因在细胞核内的转录具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无速率很高，但在细胞质内无mRNAmRNA积累，是典型的转录积累，是典型的转录后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。的强度等因素有关。 基因压制基因压制：CogoniCogoni等首先在粗糙脉孢霉的转化等首先在粗糙脉孢霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。

31、源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态导致已复制的稳定态mRNAmRNA大量减少。大量减少。 RNARNA干扰干扰：指将与靶基因的指将与靶基因的mRNAmRNA同源互补的双链同源互补的双链RNA (dsRNA) RNA (dsRNA) 导入细胞后并被切割成导入细胞后并被切割成21212323个个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的的参与下能够特

32、异地与其同源的mRNAmRNA结合并导结合并导致其降解，从而产生相应的功能表型缺失。致其降解，从而产生相应的功能表型缺失。 RNAi是植物、果蝇、线虫和包括哺乳动物在内的是植物、果蝇、线虫和包括哺乳动物在内的许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。自然存在的防御机制。RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体，从遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体，从而研究该基因的功能而研究该基因的功能. 这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前这项技术在疾病的基

33、因治疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达，或景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达，或者由蛋白过量表达引起的疾病。者由蛋白过量表达引起的疾病。( (二二) )、RNARNA干扰的发现干扰的发现 19941994年年 CogoniCogoni等证明真菌中亦等证明真菌中亦有类似现象，此称为有类似现象，此称为基因压制基因压制(quelling)(quelling)。共抑制现象共抑制现象(cosuppression)(cosuppression)上世纪上世纪9090年代初，美国和荷兰的年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组在对矮牵两个转基因植物实验组在对矮牵牛牛( (petun

34、iaspetunias) )的研究中发现的研究中发现: :转基因的植株不仅没有新基因表转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。到了抑制。19951995年，康乃尔大学的年，康乃尔大学的Su GuoSu Guo博士在博士在试图阻断秀丽新小杆线虫试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基因实验中发现：基因实验中发现：反义反义RNARNA与正义与正义RNARNA（对照）都能切断（对照）都能切断par-1par-1基因的表达。该研究小组一直未基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。能给这

35、个意外以合理解释。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀丽新小杆线虫转基因实验秀丽新小杆线虫转基因实验反义反义RNA与正义与正义RNA？反义RNA -与靶核酸与靶核酸(如如mRNA或有义或有义DNA)链互补的链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。分子，可抑制靶核酸的功能。 正义正义RNA-与与mRNA对应的对应的RNA分子。分子。RNARNA干扰的发现干扰的发现 19981998年，年，FireFire和和MelloMello（美）首次在秀丽新小杆线虫中证明上（美）首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的述现象属于转录

36、后水平的基因沉默基因沉默。他们发现。他们发现Su GuoSu Guo博士遇博士遇到的正义到的正义RNARNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNARNA技术技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNARNA中污染了中污染了微量微量双链双链RNARNA而引起：而引起：将体外转录得到的单链将体外转录得到的单链RNARNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链得十分微弱，而经过纯化的双链RNARNA却正好相反，能够高效特却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基

37、因表达的效率比纯化后异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义的反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。该小组将这一现象称为个数量级。该小组将这一现象称为RNARNA干干扰扰。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. （对照，缺（对照，缺mex-3 ，不着色），不着色）(B) Embryo from uninjected pa

38、rent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). （正常野生型，紫）（正常野生型，紫）(C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. （野生型野生型+反义反义RNA，浅紫），浅紫）(D) Late 4

39、-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) （野生型（野生型+双链双链RNA，不着色），不着色）Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC mic

40、rographs show in situ hybridization （原位杂交）（原位杂交）of 4-cell stage embryos. “沉默沉默”是是金金Fire与与Mello获获2006年诺年诺贝尔奖贝尔奖在在19991999年一年内年一年内, ,发现发现RNARNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。乎所有的真核生物细胞中。20002000年，又先后发现小鼠早期胚年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在胎中和大肠杆菌中也存

41、在RNARNA干扰现象。干扰现象。20002000年提出年提出RNAiRNAi作用机制模型。作用机制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-3320012001年，年，RNAiRNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。象。NatureNature，20012001，411411（68366836）：）：494494498498RNAiRNAi技术被技术被ScienceScience评为评为20012001年度的十大科技

42、进展之一。年度的十大科技进展之一。（三）、（三）、RNARNA干扰的机制干扰的机制 dsRNA：双链：双链RNA，包含正义链和反义链。，包含正义链和反义链。Dicer：属于：属于RNase 家族家族的一员的一员，是，是dsRNA的的特异性核酸内切酶，特异性核酸内切酶，能以一种能以一种ATP依赖的方式逐步依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链式引入的双链RNA。siRNA (small interfering RNA) ：小干扰：小干扰RNA，是长度为是长度为21-23个个nt大小的双链大小的双链RNA，为，为RNAi的

43、关的关键效应分子。键效应分子。名词解释：名词解释：siRNAslong dsRNAsiRNARISC(RNA-inducing silencing complex)： RNA诱导沉默复合物，是一种核蛋白复合物，具有核酸诱导沉默复合物，是一种核蛋白复合物，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性。内切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-dependent RNA polymerases）：）： 依赖依赖RNA的的RNA聚合酶，是聚合酶，是RNAi的调节因子，使的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递。可以在生物体内传递。RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonu

44、cleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P核酸外切酶核酸外切酶 解旋酶解旋酶 核酸内切酶核酸内切酶 dsRNA介导的同源性靶介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：降解过程主要分为两步：第一步（起始阶段）第一步（起始阶段）较长较长dsRNA在在ATP参与下，被参与下，被RNase的特异核酸酶切割加工成的特异核酸酶切割加工成2123nt的，由正的，由正义和反义链组成的义和反义链组成的小干扰小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。）。 siRNA的两条单链末端为的两条单

45、链末端为5-磷酸和磷酸和3-羟基，且羟基，且3端均有端均有2个突出的核苷酸。个突出的核苷酸。 Dicer有解旋酶活性并含有有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和结合域和PAZ结构域。结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。被发现。步骤步骤第二步（效应阶段）第二步（效应阶段）siRNA 在在ATP参与下被参与下被RNA解解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱诱导的沉默复合体导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。活化的活

46、化的RISC在单链在单链siRNA引导下识别互补的引导下识别互补的mRNA，并在并在RISC中的核酸内切酶作用下从中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中引导链中心所对应的靶基因位置切割靶心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。RNAiRNAi的放大效应机制的放大效应机制siRNA不仅可引导不仅可引导RISC切割靶切割靶RNA，而且可作为引，而且可作为引物在物在RNA依赖的依赖的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA为模板合成新的为模板合成新的dsRNA。新合成的长链新合成

47、的长链dsRNA同样可被同样可被RNase核酸酶切割、核酸酶切割、降解而生成大量的降解而生成大量的次级次级siRNA。次级。次级siRNA又可进又可进入合成入合成-切割的循环过程，进一步放大切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。作用。这种合成这种合成-切割的循环过程称为切割的循环过程称为随机降解性随机降解性PCR（random degradative PCR）。）。Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.异常的单链RNA依赖RNA的RNA聚合酶特异性核酸内切酶RNA诱导沉默复合物RNAi是转录后水平的基因沉默机制；是转录后水平的基因沉

48、默机制；RNAiRNAi具有很高的特异性：具有很高的特异性： 只有只有dsRNA才能诱导产生才能诱导产生RNAi； 只有针对编码区的只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；才能产生有效的和特异性的干扰； 注射同源注射同源dsRNA可以引起内源性可以引起内源性mRNA特异性的降解；特异性的降解； dsRNAdsRNA不得短于不得短于2121个碱基，大于个碱基，大于30bp30bp的的dsRNAdsRNA不能在哺乳动不能在哺乳动物中诱导特异的物中诱导特异的RNARNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑制凋亡；表达受抑制凋亡； RNAi具有具

49、有高效性高效性： RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；RNAi干扰的几个重要生物学特征干扰的几个重要生物学特征 RNAi具有很好的具有很好的稳定性稳定性：siRNA分子分子33端有突出的非配端有突出的非配对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在3- 4d3- 4d，以，以33端端悬垂悬垂TTTT碱基的双链碱基的双链R

50、NARNA尤为稳定，半衰期远长于反义寡聚核尤为稳定，半衰期远长于反义寡聚核苷酸。苷酸。 RNAi的的可传播性和遗传性可传播性和遗传性：RNAi抑制基因表达的效应可抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给传给F1，但，但F2往往恢复为野生型。往往恢复为野生型。 RNAi效应的依赖性：只有连续产生效应的依赖性：只有连续产生dsRNA才能产生长期才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。效应，否则只产生短暂的沉默反应。 RNAi作用迅速，作用迅速，mRNA快速降解；快速降解；miRNA及其作用机制及其作用机制miR

51、NA(microRNA) : 微小微小RNA，指长度约，指长度约2125nt的小分子单链的小分子单链RNA，位于基因组的非编码区，位于基因组的非编码区，进化上高度保守，可在进化上高度保守，可在翻译水平上翻译水平上对基因表达进行对基因表达进行调节的调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。的基因沉默。miRNA基因的表达具有特定模式基因的表达具有特定模式: 阶段特异性和组阶段特异性和组织特异性，在不同组织中表达有不同类型的织特异性，在不同组织中表达有不同类型的miRNA，在生物发育的不同阶段里有不同的在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达

52、。表达。miRNA的的作用机制作用机制相同点相同点:长度都约长度都约22 nt 左右；左右；同是同是Dicer产物，因此具有产物，因此具有Dicer产物的特点；产物的特点；二者生成都需二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在；家族蛋白的存在；同是同是RISC的组分。的组分。miRNA与与siRNA比较比较 来源不同：来源不同：siRNA来源于转基因或病毒来源于转基因或病毒RNA，由长，由长dsRNA转变而来；转变而来；miRNA来源于内源转录本，是细胞内来源于内源转录本，是细胞内RNA的固的固有组分之一，由具有发夹状结构的有组分之一，由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来；转变而来

53、； 结构不同：结构不同：siRNA主要以双链形式存在，其主要以双链形式存在，其3端存在端存在2个非个非配对的碱基，通常为配对的碱基，通常为UU；miRNA主要以单链形式存在；主要以单链形式存在； 对靶对靶RNA 的特异性不同：的特异性不同： siRNA与靶与靶mRNA完全互补配对完全互补配对结合；结合；miRNA与靶与靶RNA并不完全互补，存在错配现象。靶并不完全互补，存在错配现象。靶序列有一个核苷酸突变，就会影响到序列有一个核苷酸突变，就会影响到siRNA的作用功能，但的作用功能，但不会影响到不会影响到miRNA的功能；的功能； 作用形式不同：作用形式不同：siRNA主要在转录后通过降解主要

54、在转录后通过降解mRNA发挥作发挥作用，而用，而miRNA只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。不同点不同点:（四）、（四）、RNARNA干扰的研究方法干扰的研究方法 一般技术路线一般技术路线（五）、（五）、RNARNA干扰的应用干扰的应用 1.基因功能研究基因功能研究由于由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

55、已有研究表明已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生任何阶段，产生类似基因敲除的效应类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或将成为研究基因功能不可或缺的工具。缺的工具

56、。 2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 使用使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的研究小组设计合成的lenti病毒载体引入病毒载体引入siRNA，激发，激发RNAi使其抑制了使其抑制了HIV-1的的coreceptor-CCR5（化介素（化介素受体，受体， HIV-1的辅因子的辅因子）进入人体外周淋巴细胞，）进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种而不影响另一种HIV-1主要的主要的coreceptor-CCR4，从，从而使以而使以lenti病毒载体为媒介引导病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗

57、生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。病的可行性大大增加。艾滋病艾滋病2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 Shlomai和和Shaul设计了各针对设计了各针对HBV基因基因19nt的两种的两种pSUPER载体：载体：pSUPER X-siRNA和和pSUPER core-siRNA。已转染含。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体基因质粒载体的的Huh7细胞再被细胞再被 X-siRNA或或 core-siRNA转染后，转染后，core蛋白水平分别降低了蛋白水平分别降低了89%、63%，转染，转染X-siRNA的细胞中的细胞中HBsAg降

58、低降低60%，但转染，但转染core-siRNA对对HBsAg表达无明显影响表达无明显影响（X-siRNA干扰沉干扰沉默了所有的病毒转录物，而默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默仅沉默3.5kb、3.9kb的的mRNA）。）。 HBV（乙肝病毒）（乙肝病毒）2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对等证明了针对HCV RNA的的siRNA转染细胞转染细胞4天后可使细胞质中复制的天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低降低80倍；将倍；将siRNA 转染至已有转染至已有HCV感染、复制的细胞，感染、复制的细胞，siRNA对对98%以上可检测到以上可检测到HCV

59、抗原、抗原、HCV复制活跃的细复制活跃的细胞有抑制作用；胞有抑制作用；siRNA干扰沉默干扰沉默HCV RNA具有剂量具有剂量依赖性和序列特异性。依赖性和序列特异性。Kapadia等等 也证明了也证明了siRNA特异抑制特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。复制、阻止相关蛋白表达的作用。 HCV（丙肝病毒）（丙肝病毒）2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能细胞进行预处理可使其对病毒的抵