PPT9-荧光定量PCR(2013.5.28徐歆改)

1、定量定量PCR：检测检测PCR反应指数期某一点的反应指数期某一点的PCR产物数量，由此产物数量，由此确定初始模板的数量。确定初始模板的数量。荧光定量荧光定量PCR （real-time Q-PCR）：）：是指在是指在PCR反应体系中加反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后进程，最后通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。1996年由美国年由美国Applied Biosystems公司推出该技术公司推出该技术 实现了实现了PCR从定性到定量的飞跃从定性到定量的飞跃

2、 特异性更强、有效解决特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点污染问题、自动化程度高等特点同一样品尽管平台期同一样品尽管平台期DNADNA拷贝数波动很大，但拷贝数波动很大，但指数期产物量相同指数期产物量相同PCRPCR反应的前反应的前1515个循环的荧光信号作为个循环的荧光信号作为荧光本底信号（荧光本底信号（baselinebaseline），荧光信荧光信号之后进入指数增长阶段。号之后进入指数增长阶段。软件自动给出，无需手动设置软件自动给出，无需手动设置。荧光域值荧光域值（ Threshold Threshold ）为为3 31515个循环的荧光信号的个循环的荧光信号的标准偏差的

3、标准偏差的1010倍倍（或（或本底的本底的2 2倍）。软件自动给出，可手动设置。倍）。软件自动给出，可手动设置。CtCt值值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。 每个模板的每个模板的C CT T值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始起始拷贝数越多，拷贝数越多，C CT T值越小值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的品的CtCt值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数值，即可从标准

4、曲线上计算出该样品的起始拷贝数Primer dimersProduct of Interest每扩增一条每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步产物形成完全同步 以以lg（CT）为纵坐标，）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线扩增效率（扩增效率（E）= （10-1/斜率斜率-1） 2将未知样品的将未知样品的CT值（值（y）代入线性方）代入线性方程求得对应的程求得对应的x未知样品的拷贝数未知样品的拷贝数 = 10 x常用的有：常用的有：beta-actin，GAPDH，18

5、SrRNA等 CtSample CtNon treated sampleHousekeeping Gene Ct Ct Ct2- Ct = Change in Expression LevelGene of Interest以以TAKARA SYBRTAKARA SYBR Premix ExPremix Ex TaqTaqTMTM II II为例为例试剂试剂使用量使用量终浓度终浓度SYBR Premix Ex-TaqSYBR Premix Ex-Taq (2 (2) )10 L10 L1 1PCR Forward Primer (10 mPCR Forward Primer (10 m) )0.8 L0.8 L0.4 m0.4 mPCR Reverse Primer (10 mPCR Reverse Primer (10 m) )0.8 L0.8 L0.4 m0.4 mROX Reference Dye (50ROX Reference Dye (50) )0.40.41 1DNA DNA 模板模板2 L2 LdHdH2 2