动物组织培养细胞培养的基本条ppt课件

1、细胞培育的根本条件无菌条件：净化任务室，风淋室，传送窗，高效过滤器，无菌条件：净化任务室，风淋室，传送窗，高效过滤器，干净层流罩，生物平安柜，超净任务台，紫外干净层流罩，生物平安柜，超净任务台，紫外灯，电热枯燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素灯，电热枯燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培育板，培育瓶，细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培育板，培育瓶， CO2CO2培育箱，培育基，血清培育箱，培育基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高，微孔板震荡器，高速离心机，移液器速离心机，移液器 细胞保管条件：液氮罐细胞保管条

2、件：液氮罐实验室平安：生物实验室平安，实验室平安：生物实验室平安，P1,P2,P3P1,P2,P3实验室平安实验室平安净化任务室 - 我国药品消费干净室区空气干净度规范我国药品消费干净室区空气干净度规范 -干净度级别尘粒最大允许数/立方米尘粒最大允许数0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15风淋室风淋室: :风淋室是生物干净室的理想风淋室是生物干净室的理想配套设备，它不仅可以去除人体配套设备，它不仅可以去除人体和物品外表附着

3、的尘埃，减少带和物品外表附着的尘埃，减少带入干净室的灰尘量，而且兼有气入干净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非干净空气闸室的功能，可防止非干净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制造，吹淋口方向可调，不锈钢制造，吹淋口方向可调，风淋时间可在风淋时间可在30-9930-99秒间的调整。秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，普通控制温以加热，温度可调，普通控制温度在度在30-3530-35较为适宜。较为适宜。传送窗传送窗: :该安装是一种干净室的辅助设该安装

4、是一种干净室的辅助设备，主要用于干净区与干净区，干备，主要用于干净区与干净区，干净区与非干净区之间小件物品的传净区与非干净区之间小件物品的传送，以减少干净室的开门次数，把送，以减少干净室的开门次数，把对干净区的污染降低到最低程度。对干净区的污染降低到最低程度。PBPB系列传送窗按用途分为规范系列传送窗按用途分为规范型和生物干净型两种。后者带空型和生物干净型两种。后者带空气自净安装按门互锁方式分为机气自净安装按门互锁方式分为机械互锁和电子互锁两种外壳按资料械互锁和电子互锁两种外壳按资料分为彩钢板型、薄钢板喷塑型和全分为彩钢板型、薄钢板喷塑型和全不锈钢型三种通用型尺寸如下表所不锈钢型三种通用型尺寸

5、如下表所列，特殊规格按用户要求制造。列，特殊规格按用户要求制造。高效过滤器高效过滤器: : 高效过滤器是用超细玻璃纤维纸高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金框、木框及镀锌钢板框组合而成。金框、木框及镀锌钢板框组合而成。 特点：具有低阻高效、轻质、容尘特点：具有低阻高效、轻质、容尘量大等特点，层高的要求，减少净化量大等特点，层高的要求，减少净化设备静压箱体积等优点。设备静压箱体积等优点。 适用于常温常压常湿条件下环境空适用于常温常压常湿条件下环境空气的净化，尤其适用于需求高效空气气的净化，尤其适用于需求高效空气过滤器覆盖率高的净化厂房。过

6、滤器覆盖率高的净化厂房。干净层流罩干净层流罩: : 技术性能参数：技术性能参数： (1) (1)净化等级：净化等级：100100级级( (美国联邦规范美国联邦规范209E)209E) (2) (2)平均风速：平均风速：0.250.250.45m/s(0.45m/s(可调可调) ) (3) (3)噪音：噪音：62dB(A)62dB(A) (4) (4)电源：电源：220V/50HZ220V/50HZ 层流罩是可提供部分高干净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。层流罩是可提供部分高干净环境的空气净化设备。它主要由箱体、风机。初效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成，外壳为不锈钢或初效

7、空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成，外壳为不锈钢或彩钢板。该产品既可悬挂，又可地面支撑，构造紧凑，运用方便。可以单个彩钢板。该产品既可悬挂，又可地面支撑，构造紧凑，运用方便。可以单个运用，也可多个联接组成带状干净区域，构成干净隧道。运用，也可多个联接组成带状干净区域，构成干净隧道。 干净层流罩是将空气经风机以一定的风压经过高效空气过滤器后，由阻干净层流罩是将空气经风机以一定的风压经过高效空气过滤器后，由阻尼层均压，使干净空气呈垂直层流型气流送入任务区，从而保证了任务区内尼层均压，使干净空气呈垂直层流型气流送入任务区，从而保证了任务区内到达工艺所需的高干净度。到达工艺所需的高干净度。

8、超净任务台 n超净任务台的任务原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐经过任务台面，使任务台内构成无菌环境。 IIII级级A A型生物平安柜型生物平安柜: :一种既能使操作呵斥无菌、一种既能使操作呵斥无菌、无尘的部分空气环境，保证检验、无尘的部分空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研讨检测不受污染，又能保证被研讨的对象如病菌、细菌等不外的对象如病菌、细菌等不外溢，维护周围环境及操作人员的溢，维护周围环境及操作人员的平安隔离设备。平安隔离设备。该设备可广泛运用于低、中该设备可广泛运用于低、中等危险度病原体等危险度病原体1-31-3，DNADN

9、A重重组组P1-P3P1-P3的临床细菌学，病毒的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培育、生物学、微生物学、组织培育、生物学及生命科学的研讨，加工、检学及生命科学的研讨，加工、检验部门。验部门。紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培育室空气、操作台、塑料培育皿和培育板等外表消毒 电热枯燥箱：干热消毒电热枯燥箱：干热消毒160 ，2小时。主要用干玻璃小时。主要用干玻璃器皿消毒器皿消毒 滤 器Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培育用液，滤器：过滤除菌：大多数培育用液，如人工合成培育基、血清、酶液等均采如人工合成培育基、血清、酶液等均采用滤过法除菌用滤过法除菌大容量高压灭菌器 全自动手提式灭菌器 自动双重

10、纯水蒸馏器 纯水仪培 养 板培育瓶 常用玻璃器皿清洗 浸泡自来水、刷洗洗衣粉、酸泡24小时、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干清洁液的配制CO2培育箱nCO2培育箱设定的条件为37 ，5CO2 。n运用CO2培育箱培育细胞时应留意的问题：n 用螺旋口瓶培育细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 坚持培育箱内空气干净。定期消毒n90 ，14 h)。n箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以坚持箱内湿度，防止培育液蒸发。移液器顯微鏡酶标仪 微孔板震荡器高速离心机高速离心机 液氮罐实验室平安层流净化细胞培育室管理规那么层流净化细胞培育室管理规那么一级生物平安防护实验室一级生物平安防护实验室二级生物平

11、安防护实验室二级生物平安防护实验室三级生物平安防护实验室三级生物平安防护实验室四级生物平安防护实验室四级生物平安防护实验室层流净化细胞培育室管理规那么层流净化细胞培育室管理规那么 我院层流净化细胞培育室设计规范为万级，我院层流净化细胞培育室设计规范为万级，专供细胞培育、冻存以及细胞治疗用。层流净专供细胞培育、冻存以及细胞治疗用。层流净化细胞培育室的总体要求：经济、有序、高效、化细胞培育室的总体要求：经济、有序、高效、平安。初步制定相关制度如下：平安。初步制定相关制度如下：1 1、准入制度：、准入制度：1 1必需获得实验室相关实验技艺考试合格方可必需获得实验室相关实验技艺考试合格方可进入层流净化

12、室；进入层流净化室；2 2在本室任务的实验人员应严厉遵守本室任务在本室任务的实验人员应严厉遵守本室任务守那么，外来人员在进入净化室任务之前，必需接守那么，外来人员在进入净化室任务之前，必需接受培训；受培训；3 3没有经过培训的人员不得单独进入净化室任没有经过培训的人员不得单独进入净化室任务；务；4 4进入净化室后要坚持安静，不得大声喧哗。进入净化室后要坚持安静，不得大声喧哗。2 2、平安制度：、平安制度：1 1层流净化室内必需留意平安用电；层流净化室内必需留意平安用电；2 2谨慎运用酒精灯，不能在有明火的情况下加、谨慎运用酒精灯，不能在有明火的情况下加、换酒精；换酒精； 3 3实验人员自觉维护

13、室内设备的平安运用，对实验人员自觉维护室内设备的平安运用，对室内的仪器如室内的仪器如CO2CO2孵箱等要经常留意机器运转情况，孵箱等要经常留意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修；发现问题及时检修或报告请人检修；4) 4) 分开层流净化室必需断开必要的仪器电源；分开层流净化室必需断开必要的仪器电源；5 5对不符合层流净化室平安规定的行为自动报对不符合层流净化室平安规定的行为自动报告主管教师。告主管教师。 3 3、卫生消毒制度：、卫生消毒制度：1 1普通情况下细胞间每日消毒一次包括普通情况下细胞间每日消毒一次包括两个缓冲间，方法为紫外线消毒每次两个缓冲间，方法为紫外线消毒每次3030分钟

14、分钟至至1 1小时一次，另外每周用小时一次，另外每周用1010乳酸在紧闭门乳酸在紧闭门窗下熏蒸分钟；窗下熏蒸分钟；2 2实验终了应及时清理所用物品，留意台实验终了应及时清理所用物品，留意台面整洁；面整洁；3 3及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位置每日一次；放于指定位置每日一次； 4 4除实验必需的用品外，其它物品不得带除实验必需的用品外，其它物品不得带入净化室；入净化室； 5 5层流净化室内所用仪器及附属设备均应层流净化室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内运用，不得随意转移地点，以便他在指定范围内运用，不得随意转移地点，以便他人顺利运用；人顺利运用

15、；6 6层流净化室实施值日生担任制，值班人层流净化室实施值日生担任制，值班人员担任检查室内能否坚持清洁整齐，督促违反规员担任检查室内能否坚持清洁整齐，督促违反规定者矫正错误。定者矫正错误。4 4、出入制度：、出入制度：总体原那么为进出净化室应按次序开、关门，只总体原那么为进出净化室应按次序开、关门，只需将前面翻开的门封锁后才允许翻开下一个门，出入需将前面翻开的门封锁后才允许翻开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。1 1层流净化细胞培育室共有两个缓冲间，进入每层流净化细胞培育室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必需改换指定消毒的拖鞋；个缓

16、冲间必需改换指定消毒的拖鞋；2 2穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行分开层穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行分开层流净化室；流净化室；3 3人流：翻开细胞培育室外门，进入第一缓冲间，人流：翻开细胞培育室外门，进入第一缓冲间，开灯，封锁细胞培育室外门开灯，封锁细胞培育室外门, , 穿戴公用的干净隔离衣、穿戴公用的干净隔离衣、任务鞋帽、口罩等；翻开第一缓冲间内侧门，进入第任务鞋帽、口罩等；翻开第一缓冲间内侧门，进入第二缓冲间，新洁尔灭泡手二缓冲间，新洁尔灭泡手1 1分钟，烘干，封锁第二缓冲分钟，烘干，封锁第二缓冲间外侧门；翻开第二缓冲间内侧门，进入层流净化细间外侧门；翻开第二缓冲间内侧门，进入层流

17、净化细胞培育室胞培育室, , 封锁层流净化细胞培育室外门。封锁层流净化细胞培育室外门。4 4物流：一切进出层流净化细胞培育室的物品均物流：一切进出层流净化细胞培育室的物品均应经过传送窗进展；物品进入层流净化细胞培育室时，应经过传送窗进展；物品进入层流净化细胞培育室时，应先翻开传送窗外侧门，将物品放入传送窗，封锁传应先翻开传送窗外侧门，将物品放入传送窗，封锁传送窗外侧门，翻开紫外灯照射分钟；人员进入层送窗外侧门，翻开紫外灯照射分钟；人员进入层流净化细胞培育室后，封锁紫外灯，翻开传送窗内侧流净化细胞培育室后，封锁紫外灯，翻开传送窗内侧门，取出物品；物品出室次序与以上进室次序相反，门，取出物品；物品

18、出室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。但不需紫外线照射。培育细胞生长的条件1 细胞的营养需求2 细胞的生存环境 温度: 37 ，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 浸透压 3 无污染 4 无毒细胞培育用液的配制水：新颖配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 消化液：消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相衔胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相衔接的肽健，除去细胞间粘蛋白及

19、糖蛋白，接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分别。影响细胞骨架，从而使细胞分别。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超越一定限制会损伤细胞。越一定限制会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。分钟。 用含血清培育液终止其对细胞的消化作用含血清培育液终止其对细胞的消化作用用 培育基：培育基：培育基培育液是维持体外细胞生存

20、和生长的溶液，培育基培育液是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培育基和合成培育基。分天然培育基和合成培育基。天然培育基：天然培育基：天然培育基有血清、血浆和组织提取液如鸡胚天然培育基有血清、血浆和组织提取液如鸡胚和牛胚浸液。和牛胚浸液。优点：营养成分丰富，培育效果好优点：营养成分丰富，培育效果好缺陷：来源受限。缺陷：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。实验结果的分析。 易发生支原体污染易发生支原体污染 合成培育基：合成培育基： 合成培育基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方合成培育基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用

21、人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培育基，如法模拟合成的。目前已设计出许多种培育基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。等。 合成培育基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐合成培育基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。和其它一些辅助物质。优点：规范化消费，组分和含量相对固定。本钱低优点：规范化消费，组分和含量相对固定。本钱低 。 缺陷：缺陷： 短少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需求。短少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需求。 人工合成培育基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁衍，还需补充一定量的天然培育基如血清。血清中含有：多种

22、蛋白质白蛋白、球蛋白、铁蛋白等 ；多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 各种生长因子；转移蛋白；不明成分。普通说来，含普通说来，含5 5小牛血清的培育基对大多数细胞可以维持细胞小牛血清的培育基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长普通需加不死，但支持细胞生长普通需加 10 10血清血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子

23、，因此在含血清培育基中培育的细胞所反映的生子或毒性因子，因此在含血清培育基中培育的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反响。物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反响。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研讨领域，迫切需在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研讨领域，迫切需求用无血清培育基培育细胞求用无血清培育基培育细胞无血清培育基的主要研制战略：在根底培育基中补充各种必需无血清培育基的主要研制战略：在根底培育基中补充各种必需因子，如激素、生长因子因子，如激素、生长因子 、结合蛋白、结合蛋白 、贴壁和扩展因子、贴壁和扩展因子 等。等。无血清培育基由根底培育基和替代血清的补充成分组成。

24、无血清培育基由根底培育基和替代血清的补充成分组成。1975年，年，Sato初次胜利地用无血清培育基培育了垂体细胞株，近初次胜利地用无血清培育基培育了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培育基中胜利地生长多年来已报道了几十种细胞系在无血清培育基中胜利地生长和增殖。和增殖。无血清细胞培育基的运用保证了实验结果的准确性、可反复性无血清细胞培育基的运用保证了实验结果的准确性、可反复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。的程序。向无清培育液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。向无清培育液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培育液，很能够不适宜另一种细胞株的生适用于某种细胞株的培育液，很能够不适宜另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培育基尚处于研讨阶段，难以推行。无血清培育基尚处于研讨阶段，难以推行。目前，绝大多数人工合成培育基运用时还需添加血清。目前，绝大多数人工合成培育基运用时还需添加血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血