乙型肝炎病毒载量与其血清学标志模式关系的研究

1、乙型肝炎病毒载量与其血清学标志模式关系的研究nbsp;nbsp;nbsp;【摘要】nbsp;目的nbsp;对乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量与HBV血清标志的关系进行研究，探讨乙型肝炎病毒载量与机体免疫反应的关系，为抗病毒治疗提供科学依据。方法nbsp;用荧光定量PCR法和ELISA检测HBVnbsp;DNA 王洪 李勇年 陈玉湘 李梅玲 【摘要】 目的 对乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量与HBV血清标志的关系进行研究，探讨乙型肝炎病毒载量与机体免疫反应的关系，为抗病毒治疗提供科学依据。方法 用荧光定量PCR法和ELISA检测HBV DNA和抗原抗体，统计分析不同HBV DNA量的抗原抗体表达

2、模式。结果 所有病例中，90.9%为HBsAg阳性，85.3%抗-HBc-IgG阳性。HBsAg和BeAg双阳性模式中，HBV载量10 5 /ml10 7 /ml者，占29.9%，HBV载量10 7 /ml者，占54.9%。在HBsAg阳性，抗-HBe阳性模式中，HBV载量10 5 /ml10 7 /ml者和HBV载量10 7 /ml者各占29.4%和31%。HBeAg阳性模式HBV载量显著高于HBeAg阴性模式，抗-HBe阴性模式HBV载量显著高于抗-HBe阳性模式。结论 HBeAg阳性模式HBV载量显著高于HBeAg阴性模式，抗-HBe阴性模式HBV载量显著高于抗-HBe阳性模式。但在少部

3、分患者刚好相反，因此，对一个具体的患者，不能只根据抗原抗体模式来判断病毒复制程度及其传染性的强弱。 关键词 乙型肝炎病毒 聚合酶链反应 酶联免疫吸附实验 Observation on relationship between the quantities of virus and the models of serologic markers in patients infected with HBV Wang Hong，Li Yongnian，Chen Yuxiang，et al. Department of Infection Diseases，323Hospital of PLA，XiA

4、n710054. 【Abstract】 Objective To explore the relationship between the quantities of HBV and the models of serologic markers.Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was used to measure the HBV DNA and ELISAwas used to detct the antigen/antibody of HBV.Results The HBsAg positive rate was90.9%，a

5、nti-HBc-IgG was85.3%.The patients whose HBV copies were more than10 7 /ml accounted for54.9%，whose HBV DNA copies was10 5 /ml10 7 /ml accounted for29.9%among the HBsAg and HBeAg positive patients.The patients whose HBV copies were more than10 7 /ml and10 5 /ml10 7 /ml accounted for31%and29.4%among t

6、he anti-HBe positive patients，respectively.The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.The HBV copies of anti-HBe-negative patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.Conclusions The HBV copies of HBeAg-positive patients were

7、 significantly more than HBeAg-negative patients，The HBV copies of anti-HBe-negative patients were significantly more than anti-HBe-positive patients.However，some HBeAg-positive patients HBV copies are very low，and some HBeAg-negative patients HBV copies are very high.HBVDNA could be detected in som

8、e HBeAg-negative patients.It is difficult to judge accurately the quantities of HBV and infectivity according to the serologic markers for a specific patient. Key words hepatitis B virus polymerase chain reaction fluorescent-probe real-time enzyme-link immunosorbent assay 乙型肝炎病毒（HBV）载量与抗原抗体的关系是临床、流行

9、病学和基础研究中共同关心的问题。近年建立的荧光定量PCR方法，为定量观察病人提供了一个敏感的指标，荧光定量PCR具有敏感性高，重复性好，特异性强，定量范围宽等优点 13 。我们用这个方法检查我科537例门诊患者HBV载量，以探讨感染HBV后患者的血清病毒水平与抗原抗体的关系，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 病例 均为我院2002年11月2003年6月门诊患者，年龄和性别不限，近半年内无使用干扰素、拉米夫定史。所有入组病例肝功化验ALT正常或低于正常上限的2倍，总 胆红素正常。采静脉血，当日分离血清，检测，或4保存，次日检测。一般进行1次HBV-DNA定量和抗原抗体检查，对于HBeA

10、g阳性而病毒拷贝数低，抗-HBc阴性而病毒拷贝数高，HBeAg和抗-HBe、HBsAg和抗-HBs同时阳性者均进行复查。 1.2 HBV抗原抗体测定 采用ELISA法，试剂由上海科华生物工程股份公司提供，由专人按产品说明书操作，目测定性检查。 1.3 HBV定量检测方法 1.3.1 仪器、试剂及试剂盒的使用方法 测定仪器为Roche公司Lightcycler荧光定量基因分析仪。试剂由深圳匹基生物公司提供（SDA审批），采用常规的碱裂解法，从血清中提取HBV-DNA，加入Roche毛细玻璃管中，放入Light cycler自动荧光检测仪，按下列条件扩增:373min925s6030s，共40个循

11、环，反应结束后，由电脑自动计算出定量结果。 1.3.2 定量方法 HBV-DNA定量PCR采用实时FQ-PCR，以起始模板拷贝数的常用对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标，用阳性梯度标准品制定标准曲线，相关系数r0.98，计算标本中起始DNA模板量。以拷贝数表示DNA含量，检测灵敏度为10 3 拷贝/ml。 1.4 统计分析 以HBV-DNA含量为分组依据，组间HBV-DNA含量相差10 2 拷贝/ml。抗原抗体排列顺序:a HBsAg（+），b抗-HBs（+），c HBeAg（+），d抗-HBe（+），e抗-HBc-IgG（+），f抗-HBc-IgM（+）;以阳性项目的序号代表阳性项，同一患者出

12、现的抗原抗体组合称为抗原抗体模式，按抗原抗体模式数量统计分析。 2 结果 2.1 一般资料 537例门诊患者，其中男420例、女117例，男女之比3.6:1，年龄为475岁，1660岁者占85.5%。统计结果如下。 抗原抗体模式:在本研究的病例中，HBsAg阳性488例，占总数的90.9%，抗-HBc-IgG阳性458例，占总数的85.3%。共有10种抗原抗体模式。其中a+c+e+f和a+c+e模式（大三阳）313例，占总数的58.3%。a+d+e模式（小三阳）100例，占总数的18.6%。而b+d和b+e模式分别有22例和16例。 HBV载量:在所有患者中，HBsAg和HBeAg双阳性模式中

13、（a+c+e+f、a+c+e和a+c+d），HBV载量10 7 /ml者178例，占54.9%。HBsAg阳性，抗-HBe阳性模式（a+d+e和a+d），HBV载量10 7 /ml者37例，占31%。双抗体模式中，b+d模式22例，其中HBV载量10 3 拷贝/ml者9例，占40.9%，HBV载量10 3 /ml10 5 /ml者10例，占45.5%。b+e模式16例，其中HBV载量10 3 拷贝/ml者5例，占31.2%，HBV载量10 3 /ml10 5 /ml者11例，占68.8%。在所有患者中，HBsAg和HBeAg双阳性模式HBV DNA拷贝数显著高于HBeAg阴性模式（P10 7

14、/ml组，分别达到25.2%和60.8%，本研究结果与文献报道的结果相似。但HBV拷贝数10 3 组仍有6.5%，可能与机体强大的免疫作用对病毒复制的抑制有关。抗-HBe阳性模式即HBeAg阴转并已经出现HBeAg的血清学转换，在不同的HBV DNA载量患者中，比例并没有大的差异，但低病毒载量所占比例明显升高。在该模式中，HBV DNA载量高的患者仍有一定比例，抗-HBe阳性而HBV拷贝数高，可能与HBV基因变异有关。当前C基因发生终止密码子变异时（nt1896由G变为A），或当C启动子（nt17441804）变异时，HBeAg表达终止或减少70%，此时病毒仍有复制 6，7 。并且有研究还认为

15、前C基因发生变异时，不仅病毒复制仍在继续，而且还可能加重肝损伤（本研究未对感染者进行临床分析，对此不做进一步的讨论）。因此。如果排除前C基因变异这个因素的影响，高病毒载量的抗-HBe阳性患者会明显减少，低复制患者所占比例升高。 抗-HBs阳性者总共38例，而且HBV拷贝数105/ml，提示在部分HBV低复制条件下，可能出现抗-HBs阳性的HBV感染者。HBsAg的消失和抗-HBs的出现一般表示HBV感染的恢复，HBsAg阴性的HBV感染是近年颇受关注的问题，在HBV抗病毒治疗过程中，部分患者HBsAg从血清中消失后，HBV DNA仍可持续存在于患者的血液、肝脏中。抗-HBs是中和性抗体，可以防

16、止游离病毒感染正常肝细胞。抗-HBs阳性的HBV感染可能系曾经接种HBV疫苗并产生抗-HBs，但感染了“a”抗原决定簇变异的HBV。“a”抗原决定簇是HBV中和抗体作用的靶位，如发生变异，一方面产生的抗原不能被常规的免疫试剂检测到，另一方面变异病毒株可逃避抗体的中和作用。 本研究证明，HBsAg和HBeAg双阳性模式HBV DNA拷贝数显著高于HBeAg阴性模式，高病毒复制多表现出HBeAg阳性，而低病毒复制多表现为HBeAg阴性、抗-HBe阳性。但是，在HBeAg阳性模式中，部分患者HBV DNA拷贝数很低，在HBeAg阴性模式中，部分患者HBV DNA拷贝数高。因此，对一个具体的患者，不能

17、只根据每个抗原抗体模式来推测病毒复制程度及其传染性的强弱。定量PCR方法检测的是病毒核酸水平，抗原抗体模式是病毒蛋白水平，临床判断分析时，应多方面综合考虑 8 。 参考文献 1 Pas SD，Fries E，De Man RA，et al.Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays.J Clin Microbiol，2000，38:2897-2901. 2 Loeb KR，Jerome KR，

18、Goddard J，et al.High-through put quantitative analysis of hepatitis B virus DNA in serum using the TaqMan fluorogenic detection system.Hepatology，2000，32:626-629. 3 Weinberger KM，Wiedenmann E，Bohm S，et al.Sensitive and accurate quantitation of hepatitis B virus DNA using a kinetic fluorescence detection system（TaqMan PCR）.J Virol Methods，2000，85:75-82. 4 Milich DR，McLachlan A.The nucleocapsid of hepatitis B vir