永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

1、永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性 07-08-21 15:40:00 编辑：studa20 作者：李羽，白雪帆，王军，徐哲，张岩【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its biological characte

2、ristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte cl

3、ones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The imm

4、ortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal

5、hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes, and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterization; SV40; liposom

6、es【摘要】 目的: 构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果： 经G418 700300 mg/L筛选，40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论： 新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细

7、胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体【中图号】 R512.60引言原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命. 研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择1-5. 而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细

8、胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择. 从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.1材料和方法1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 1428 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigm

9、a公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.1.2方法1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamH单酶切，10 g/L琼脂糖电泳. 回收含目的DNA片段的凝胶，纯化后用T4 DNA连接酶与pcDNA3.1空载体进行连接. 制备感受态细胞并提取重组质粒. 用限制性内切酶BamH进行酶切，10 g/L琼脂糖电泳鉴定.1.2.2胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA

10、，37，pH 7.4，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和气体）以20 mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉. 灌注5 min至肝脏变色后改为含0.05 g/L胶原酶的Hanks液（37，pH 7.4，通以含950 mL/L O2，50 mL/L CO2的混合气体）持续灌注5 min. 取下肝脏，置于含4 Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500 r/min清洗离心次，每次2 min，弃上清，以4 Hanks液重悬，台盼蓝（Trypan Blue）染

11、色判断细胞活率，肝细胞活率90时，计数制成肝细胞悬液，以终浓度1105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰岛素，培养48 h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/pcDNA3.1转染至胎肝细胞. 用含700 mg/L G418的培养液筛选1 wk，将G418浓度改为300 mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.1.2.3细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的超微结构.1.2.4细胞生长曲线的测定细胞消化后制成悬液，以103浓度接种于96孔板内，37，50 mL/L C

12、O2孵箱内培养，每天取8孔加入MTT溶液20 L/孔, 37继续孵育4 h，终止培养吸去上清，加入150 L DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测定光吸收值取平均值，连续测定12 d. 以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线.1.2.5细胞克隆形成率肝细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板，连续培养15 d，在倒置显微镜下观察含有50个以上细胞的细胞克隆数，按下列公式计算细胞克隆形成率：克隆形成率（%）（克隆数/接种细胞数）100%.1.2.6软琼脂试验肝细胞预先制成细胞悬液，在60 mm培养皿中预先铺上含12 g/L琼脂的培养基，将细胞以1105/

13、皿浓度与37预温的含6 g/L琼脂的培养基混匀后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养20 d后观察克隆形成数.1.2.7染色体检查取对数生长期的肝细胞加入终浓度为0.5 mg/L的秋水仙碱，继续作用4 h，收集分裂中期细胞，离心去上清，加入0.075 mol KCl低渗处理20 min，最后经甲醇冰乙酸固定，制片，Giemsa染色后，在油镜下观察染色体形态.1.2.8免疫组织化学方法检测整合的SV40T基因及ALB在细胞中的表达新建胎肝细胞系常规爬片，PBS清洗，4丙酮固定，30 mL/L H2O2处理，血清封闭，分别滴加人血清白蛋白单克隆抗体及SV40T单克隆抗体，孵育60 min，然后滴加HRP标记的二抗，孵育60 min，苏木精复染. 脱水、透明、封片、镜检.2结果2.1重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/pcDNA3.1经BamH单酶切，酶切产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600 bp及5600 bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段大小（图1）.图1重组质粒酶切鉴定（略）2.2胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%