进出口食品中铅、砷、镉、汞、铬、镍、锑、锡、硒、铜、锌等有害元素形态的测定 液相色谱电感耦合等离子体_质谱法 编制说明8486

1、进出口食品中铅、砷、镉、汞、铬、镍、锑、锡、硒、铜、锌等有害元素形态的测定 液相色谱-电感耦合等离子体_质谱法 编制说明8486 进出口食品中汞形态的测定-液相色谱-电感耦合等离子体/质谱法编制说明一、任务来源 本检验方法标准的制定工作,是依据国家认证认可监督管理委员会国认科函201088号文件关于下达2008年出入境检验检疫行业标准制修订计划项目的通知要求而进行的,项目编号为2008B172,本标准由宁波出入境检验检疫局和深圳出入境检验检疫局承担研究和起草工作。二、标准制定的意义及工作路线1、意义 汞及其化合物不仅是一类毒性很高的持久性有毒污染物,还是一种全球性的污染物。在过去的几十年中,全

2、球性的汞污染已经给人类的生活和健康造成了很大的影响。根据美国环境保护署USEPA的报告,2000年美国将近500万名妇女体内的汞含量高于安全标准,每年可能有高达30万名新生儿因为汞的侵害而使其智力和神经系统受到影响。 我国是目前世界上汞使用量最大的国家之一。据统计,2000年世界汞产量约2000吨,而中国汞的年使用量达900多吨,约占世界总产量的二分之一。汞及其化合物的大量使用也已经给我国造成了严重的环境污染。第二松花江和蓟运河区域在上个世纪七、八十年代都曾出现过严重的汞污染,目前贵州省由于汞矿开采和燃煤造成大气、水体和土壤中汞的含量都严重超标。我国城市地区大气和土壤汞含量的超标比例也是逐年上

3、升。 食品摄入是人体中汞的重要来源之一。环境中的汞可以通过食物链的传递和累积,最终影响人们的身体健康。研究表明,我国居民每人每天饮食中汞的平均摄入量为10.3 g,远高于瑞典(1.8 g)、芬兰(1.9 g)、美国(3.2 g)和英国(4.0 g)等发达国家。尽管我国卫生部早在1994年8月10日就批准并实施了食品中汞的限量卫生标准GB 2762-94,但是对于各类食品中汞的含量范围及污染水平并不清楚。因此,开展食品中汞的污染研究仍具有重要意义。 随着对环境化学研究的日益深入,人们越来越认识到元素的不同形态对环境和生物的作用存在着巨大差异,如:甲基汞的毒性比无机汞的毒性大得多,三价砷的毒性比一

4、甲基砷和二甲基砷的毒性大等。因此,进行元素的形态分析而不是总量分析成为一种发展趋势。二十世纪六十年代,日本水俣病事件的发生使甲基汞的形态分析成为研究的热点。West?首先建立了气相色谱(GC)与电子捕获检测器(ECD)联用测定甲基汞化合物的方法。随后,气相色谱与各种检测器的联用成为有机汞化合物形态分析的主要方法。但同一根气相色谱柱很难实现不同极性的Hg2+和CH3CH2Hg+的完全分离,常规的做法是采用极性不同的并联柱、串联柱或分别测定。我国虽然在1997年就制定了地面水及污水中甲基汞和乙基汞的分离分析方法GB/T 17132-97,但该方法使用巯基棉富集和甲苯萃取,毒性较大。而且方法采用电子

5、捕获检测器测定,选择性和灵敏度较差,已经不能满足汞形态分析的要求。近年来,元素的形态分析方法研究有了很大的发展,各种色谱包括气相色谱、液相色谱和离子色谱及联用技术被广泛用于元素的价态或形态分析,常用的检测器主要有电子捕获检测器ECD、紫外分光光度检测器UV、原子吸收光谱仪AAS、微波等离子体-原子发射光谱仪MIP-AES和电感耦合等离子体-质谱仪ICP-MS等。其中ECD和UV是最早使用的检测器,由于二者选择性差、基体干扰严重,目前已很少使用;AAS选择性高,和气相色谱及液相色谱联用的接口相对比较简单,但其灵敏度较差,不能满足痕量及超痕量分析。 在我国,GB 2762-2005食品中污染物限量

6、中规定所有水产品(不包括食肉鱼类)中甲基汞的限量值为0.5mg/kg,食肉鱼类中甲基汞的限量值为1.0mg/kg;GB 18406.4-2001农产品安全质量 无公害水产品安全要求则规定我国总汞的限量值为0.3mg/kg,其中甲基汞不得超过0.2mg/kg。另外,GB 10132-2005鱼糜制品卫生标准、GB 10136-2005腌制生食动物性水产品卫生标准、GB 14939-2005鱼类罐头卫生标准、NY 5073-2006无公害食品 水产品中有毒有害物质限量等标准中对甲基汞的限量与GB2762-2005相同。 世界卫生组织1972年建议,成人每周汞暂定容许摄入量不得超过0.3mg(相当于

7、5g/kg体重),其中甲基汞摄入量不得超过每人每周0.2mg(相当于3.3mg/kg.bw)。2003年,JECFA将甲基汞的PIWI值由3.3mg/kg.bw降至1.6 mg/kg.bw。美国环保局(EPA)推荐汞的准许摄入量为0.1g/kg.bw.d,即0.7g/kg.bw.w。CAC/GL7-1991鱼甲基汞指导值规定了甲基汞的限量,其中食肉鱼为1.0mg/kg,非食肉鱼为0.5mg/kg;FAO/WHO规定汞的限量为1mg/kg;欧盟规定能够汞的饮食限量为0.5mg/kg,(EC)No1881/2006规定水产品及鱼肉中汞的限量值为0.5mg/kg;日本规定了水产品中总汞限量值为0.4

8、mg/kg,甲基汞限量值为0.3mg/kg(此规定不适用于河川淡水鱼);美国规定鱼类的甲基汞限量为1.0mg/kg(湿重);韩国规定鱼类总汞限量为0.5mg/kg(深海鱼类、金枪鱼类及辅鳍类除外),鱼类甲基汞限量为1.0mg/kg(深海鱼类、金枪鱼类及辅鳍类);瑞典规定水产品中汞小于1.0mg/kg。由此可见,各国对汞形态的划分逐渐细化,对不同形态的汞进行测定势在必行。 本标准通过研究进出口食品中重点监测的有害元素汞的具体形态分析技术,以期开发出具有高灵敏度、高选择性的新型分析检测技术。同时,通过对液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术的系统研究,可以建立有效的汞元素形态分析技术,实现对肉、禽

9、、蛋、奶、水产品等样品中汞的准确检测,具有很强的实际应用价值和应用前景。2、工作路线及方法2.1 技术路线 本研究以不同基质的样品(动物性固体样品、植物性固体样品及液体样品)为对象,对样品中几种不同汞形态进行提取和净化,并优化了提取溶剂、提取方式、提取时间、净化步骤等条件。具体技术路线如下:2.2 研究方法及步骤2.2.1 仪器设备 1)液相系统:岛津高效液相色谱议,日本Shimadzu公司,配有脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱;2)电感耦合等离子体质谱系统: i CAP Qc 电感耦合等离子体质谱仪,美国Thermofisher公司; 3)微波形态萃取仪(奥地利 Anton Paar

10、公司); 4)Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); 5)CR21G型高速冷冻离心机(美国Sigma公司)。2.2.2 试剂与材料 水:经Milli-Q净化系统(0.22 m滤膜)过滤的超纯去离子水;1)乙酸铵:色谱纯。2)L-半胱氨酸:生化试剂。3)25%四甲基氢氧化铵水溶液:分析纯。4)甲醇:色谱纯。5)氨水:分析纯。6) 0.1%L-半胱氨酸- 10 mmol/L 乙酸铵-氨水溶液:称取0.771 g乙酸铵和1.0 g L-半胱氨酸,加入900 mL超纯水溶解,用氨水调节pH至7.0,加水至1000 mL。7)滤膜:0.45 m,有机系。2.2.3 标准物质及溶液1)标准

11、储备液:氯化汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞标准溶液。各形态标准储备液浓度为100mg/L,4冰箱保存备用。2)标准工作溶液:吸取4种汞的标准储备液各10 L到10 mL容量瓶中,配得混合标准工作溶液0.1 mg/L。分别吸取混合标准工作液0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL于一组10 mL容量瓶中,用0.1%L-半胱氨酸- 10 mmol/L 乙酸铵-氨水溶液定容至刻度,得到各种汞形态的浓度(以汞计)分别为0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的混合标准溶液,使用时现配。2.2.4 仪器条件 1)微波萃取条件:设定微波萃取方法参

12、数,加热温度为120,加热时间10 min。液相条件: 色谱柱:Agilent Eclipse XDB C 18柱,长150 mm,内径4.6 mm,粒度5 m ,或相当者; 流动相:A相甲醇,B相0.1%L-半胱氨酸- 10 mmol/L 乙酸铵-氨水溶液; 梯度洗脱条件见表1; 柱温:30; 进样量:50.0 L。表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间 min 流动相A % 流动相B % 流速 mL/min 0 8 92 1.0 1.0 8 92 1.0 2.0 50 50 1.0 5.0 50 50 1.0 6.0 8 92 1.0 10.0 8 92 1.0质谱条件: 功率:1550 W;

13、雾化器:同心雾化器; 冷却气流量:14L/min; 辅助气流量:0.80 L/min; 采样深度:5.0 mm; 采集质量数:汞202; Pt采样锥和截取锥; 氧气加入量:2.83%; 积分时间:0.1 s; 载气:氩气,纯度99.999%; 蠕动泵转速40 rpm。2.2.5 标准曲线 用0.1%L-半胱氨酸- 10 mmol/L 乙酸铵-氨水溶液稀释标准中间溶液,配置一系列标准溶液。浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的混合汞标准溶液进行HPLC-MS/MS测定,分别进样50L, 平行测定3次。以峰面积 Y为纵坐标,质量浓度X 为横坐标进行回归分析

14、,得到标准曲线、线性范围、相关系数。2.2.6 实验方法2.2.6.1提取条件优化 称取0.5 g试样(精确至0.001 g)于10 mL微波形态萃取管中,加入4mL25%四甲基氢氧化铵,置于微波形态萃取仪中120萃取10min,萃取完毕后转置15mL离心管中,以0.1%L-半胱氨酸- 10 mmol/L 乙酸铵-氨水溶液定容10.0 mL,过0.45m有机相微孔滤膜上机。2.2.6.2检测条件的优化 采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP/MS)检测汞的形态,对色谱柱、流动相、样品溶剂、质谱参数等进行研究,确定最佳检测条件。2.2.6.3回收率和精密度的研究 称取不同种类的

15、进出口食品(蔬菜、鸡蛋、肉、鱼、牛奶),添加检出限,2倍检出限,限量值三个浓度水平的标准溶液,按照确定的最佳实验方法进行HPLC-ICP/MS测定,每一水平测定6次,计算平均回收率和精密度。2.2.6.4稳定性实验的研究 取同一批样品溶液,在同一天的不同时间点进行测定(每2个小时测定一次,连续测定5次),峰面积的RSD值为日内精密度,在5天内每日的同一时间点进行测定,峰面积的RSD值为日间精密度。2.2.6.5实际样品的测定 按照实验方法对进出口食品进行检测。三、条件实验 本方法在样品前处理条件优化上进行了较细致地研究和论证,在仪器检测条件上进行了比较和优化,最终确定了该标准所采用的检测技术。

16、1 萃取条件的优化 本方法考察了微波萃取汞形态的提取条件,包括萃取溶剂、萃取时间和萃取温度。萃取溶剂的选择 碱消解方法是萃取生物组织中汞化合物常用的样品前处理方法。通过碱消解,样品中的汞化合物会100%释放出来。本方法选择25%KOH-甲醇溶液、25%四甲基氢氧化铵溶液和40%四丁基氢氧化铵溶液做萃取溶剂,对鱼肉甲基汞标准物质进行微波萃取,结果发现采用25%四甲基氢氧化铵溶液对样品进行萃取,样品消解完全,分离时四种组分分离完全,峰型对称,因此实验选择25%四甲基氢氧化铵溶液作为萃取溶剂。萃取时间的影响 本实验采用鱼肉样品加标,选择25%四甲基氢氧化铵溶液作为萃取溶剂,固定萃取温度为100,考察

17、了不同萃取时间对萃取率的影响,结果见图1。从图1可以看出当萃取时间超过10min以后,结果基本稳定,因此实验中选择萃取时间为10min。图1 萃取时间对测定结果的影响萃取温度的影响 本实验采用鱼肉样品加标,选择25%四甲基氢氧化铵溶液作为萃取溶剂,固定萃取时间为10min,考察了不同萃取温度对萃取率的影响,结果见图2。从图2可以看出对于三种有机汞,萃取温度对萃取的结果并无明显影响,但是对于无机汞而言,随着温度的升高,萃取结果迅速上升,当萃取温度到达120时,萃取结果基本不再有显著增长,因此实验中选择萃取温度为120。图2 萃取温度对测定结果的影响2色谱条件的选择2.1色谱柱的选择 有文献报道采

18、用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18、Bonus-RP C18、Eclipse XDB C18柱均可较好的分离四种形态的汞,本实验在实验室的现有条件下,考察了Waters Sunfire和XBridge C18、Shiseido ACR C18、Agilent Eclipse XDB C18四种色谱柱,发现Agilent Eclipse XDB C18色谱柱可以在较短的时间内,较好的实现四种形态的汞的分离,并且峰型较好。因此本实验选择Agilent Eclipse XDB C18柱作为分离柱。2.2流动相的选择2.2.1 L-半胱氨酸的用量 L-半胱氨酸的加入,可以

19、对汞化合物起到络合作用,从而在反相色谱柱上有所保留。L-半胱氨酸的加入量对分离的影响结果见图3。当不加入L-半胱氨酸时,四种形态的汞无法分离,谱图上出现单峰;当L-半胱氨酸用量较少时,汞的峰型很差,峰响应值较低而峰型较宽;随着L-半胱氨酸用量的增加,峰型有所改善,拖尾现象减弱,响应增强。但是L-半胱氨酸的加入对色谱柱损害较大,严重影响柱子的寿命,因此,综合考虑分离和保护色谱柱,实验选择流动相中L-半胱氨酸的用量为0.1%。图3 L-半胱氨酸加入量对分离的影响2.2.2 乙酸铵的浓度 实验考查了不同浓度的乙酸铵对分离的影响,结果见图4。图4标明,在流动相中加入少量的乙酸铵可以有效地改善峰型,减少

20、峰展宽。当乙酸铵浓度为10mmol/L时,分离效果最好,因此实验选择流动相中乙酸铵的浓度为10mmol/L。图4 乙酸铵浓度对分离的影响2.2.3 pH的影响 实验考察了pH对分离的影响,结果见图5。在pH5.0-9.0的范围内,随着pH的增加,三种有机汞的保留时间有所延长,响应值有所下降,整体来说对分离的影响不大,因此实验选择流动相的pH为7.0。图5 pH对分离的影响2.3 质谱条件的优化 由于在汞的分离时采用了较高的有机相,因此在采用ICP-MS测定时,需要加入氧来避免积炭,实验考察了氧气的加入量对峰面积的影响,结果见图6。从图6可以看出,随着加氧量的增加,四种形态的汞峰面积都出现降低的

21、趋势,这是因为氧气的加入,会使仪器灵敏度降低,但是如果加氧太少,又会因为有机溶剂的不完全燃烧造成锥孔积炭。综合考虑,选择加氧量为2.83%。图6 加氧量对峰面积的影响3 标准曲线和检测限 由实验得出四种形态的汞在质量浓度0.220 ng/mL的范围内呈线性关系,回归方程分别为Y25113.468X+2378.568、Y26109.687X-516.946、Y40717.933X-5597.412、Y25231.039X+544.974,相关系数分别为1.000、1.000、1.000、1.000,如图7所示。以3倍信噪比S/N 为方法检出限LOD,以10倍信噪比S/N 为方法定量限LOQ,经样

22、品添加实验确定在进出口食品中四种形态的汞的检出限均为4g/kg,定量限为10g /kg。图7 汞的标准曲线4 回收率和精密度 采用蔬菜、鸡蛋、鱼肉、猪肉、牛奶和奶粉,分别进行添加回收率实验,其结果见表2。表2 四种形态的汞的回收率实验结果 n 6样品种类加标回收率(%)0.01mg/kg0.02mg/kg0.2mg/kg0.5mg/kg1.0mg/kg大豆无机汞75.9-78.289.2-97.2105.8-108.6/甲基汞102.0-106.298.8-99.7101.2104.4-/乙基汞67.4-74.585.3-109.582.6-88.1/苯基汞65.2-70.361.6-64.3

23、91.5-93.1/牛奶无机汞91.5-94.497.3-108.996.8-101.2/甲基汞110.9-114.7112.9-118.4108.0-108.2/乙基汞113.6-117.6113.2-116.492.1-95.6/苯基汞101.2-102.988.5-95.0104.2-107.6/奶粉无机汞114.1-117.2109.6-110.898.2-104.4/甲基汞69.4-87.1107.5-109.6102.1-107.4/乙基汞106.4-115.1103.3-113.6104.7-105.9/苯基汞111.0-117.589.1-101.3105.0-109.1/菠萝

24、无机汞103.9-104.398.2-104.9106.1-108.0/甲基汞98.3-102.696.7-99.8108.2-108.8/乙基汞97.8-102.0115.1-119.2101.4-107.5/苯基汞90.2-110.3103.1-109.690.4-98.4/猪肉无机汞75.8-107.274.0-85.5109.1-109.7/甲基汞108.8-109.5104.7-106.2107.3-108.9/乙基汞95.6-110.2105.4-107.8104.3-104.5/苯基汞101.3-101.6102.2-104.4106.2-106.7/鸡蛋无机汞76.5-97.2

25、76.1-82.9103.6-110.0/甲基汞102.3-106.3104.7-105.1100.7-104.3/乙基汞100.7-107.698.9-102.898.4-108.4/苯基汞90.2-97.890.2-96.4107.5-108.3/虾仁无机汞61.3-65.496.8-107.3102.3-110.0/甲基汞69.4-93.399.0-113.780.1-88.4/乙基汞85.8-89.180.3-90.181.8-89.6/苯基汞88.5-92.296.1-98.980.6-83.5/鳕鱼无机汞64.7-89.760.8-67.1/108.9-109.8/甲基汞64.7-

26、88.779.7-85.1/107.2-108.5/乙基汞81.4-84.687.5-99.3/107.2-107.4/苯基汞88.3-95.187.8-92.0/106.8-108.5/金枪鱼无机汞100.7-101.5101.7-112.5/108.5-108.9甲基汞110.3-115.9104.9-114.9/114.0-106.3乙基汞75.5-78.194.6-104.2/106.2-106.6苯基汞82.4-84.189.0-97.1/104.7-109.35 稳定性实验 经实验测定日内精密度小于8%,日间精密度小于10%,这说明四种形态的汞的提取液较稳定,可以用于复检测定。6

27、实际样品测定 按照本实验方法对食品进行了分析测定,结果在几个水产品中检出无机汞,在食肉鱼中检出甲基汞,在鸡蛋中检出乙基汞,所有样品均未检出苯基汞。图8-14为各基质样品的测定色谱图及加标结果。图8非食肉鱼样品测定汞形态的色谱图及加标结果图9 食肉鱼样品测定汞形态的色谱图及加标结果图10 虾仁样品测定汞形态的色谱图及加标结果图11 猪肉样品测定汞形态的色谱图及加标结果图12 菠萝样品测定汞形态的色谱图及加标结果图13 鸡蛋样品测定汞形态的色谱图及加标结果图14 大豆样品测定汞形态的色谱图及加标结果四 协同性验证试验 本标准方法得到了ThermoFisher科技、福建省产品质量检验研究院、浙江出入

28、境检验检疫局、温州出入境检验检疫局、济南出入境检验检疫局5家单位的支持,对实验方法进行了协同性验证实验,验证实验对两种样品采用添加测定回收率对进行验证,验证结果证明该方法满足相关要求。 表2 协同验证实验结果汇总基质形态添加水平(g/kg)回收率(%)ThermoFisher科技福建省产品质量检验研究院浙江出入境检验检疫局温州出入境检验检疫局济南出入境检验检疫局食肉鱼无机汞10109.3111.7119.7110.2113.9109.2118.2110.8112.8117.320108.5109.1112.8109.2105.8117.5109.4107.2110.5114.21000108.

29、0106.2108.9106.0106.1102.4108.8106.9108.6105.9甲基汞10104.6103.8110.4107.7117.3115.2110.4109.9109.4114.220108.9107.3109.3109.6109.6105.9118.8111.4107.2108.11000102.7105.3105.5106.2107.1109.6110.0108.5104.5107.4乙基汞1079.282.188.589.369.280.678.986.588.985.32080.583.692.490.877.981.393.789.180.185.7100095

30、.593.998.197.891.582.093.891.390.287.5苯基汞1080.281.779.277.688.384.599.296.190.492.62083.882.680.283.690.297.990.288.792.291.9100096.297.889.491.598.2104.898.290.696.397.8牛奶无机汞10114.8116.2107.4114.267.372.9102.5119.2114.9115.220112.5110.2111.8109.783.290.1118.2106.1110.7109.4200107.2107.8110.5108.410

31、8.5105.9103.5119.8116.2108.8甲基汞10118.3116.4115.8119.0114.6109.4108.0116.5117.3113.520111.2112.7113.9109.5108.3118.3108.4117.2113.3117.2200105.3103.9110.3102.5109.2112.7115.8109.5110.2109.4乙基汞1069.967.373.679.3108.2119.080.977.372.479.72070.472.580.684.6103.7108.589.493.380.378.220084.585.879.381.992

32、.998.186.390.182.482.7苯基汞1070.868.280.278.1103.8108.695.397.983.481.52077.277.783.477.5100.799.293.090.687.689.420089.390.682.387.6103.2107.591.994.395.393.6进出口食品中无机硒的测定?高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法编制说明一、任务来源 本检验方法标准的制定工作,是依据国家认证认可监督管理委员会国认科函201088号文件关于下达2010年出入境检验检疫行业标准制修订计划项目的通知要求而进行的,项目编号为2010B285k,本标准是国家科

33、技部十一五科技支撑项目功能性食品有效成分检测和鉴伪技术的研究(计划编号:2006BAD27B02)的输出标准项目,本标准由中国检验检疫科学研究院和黑龙江出入境检验检疫局承担研究和起草工作。二、标准制定的意义 硒是人体必需的营养元素之一,被国内外医药界和营养学界尊称为“生命的火种”,享有 “抗癌之王”、“心脏守护神”和“天然解毒剂”等美誉。硒对人类健康的巨大作用是其他物质无法替代的。缺硒会直接导致人体免疫能力下降、未老先衰,严重缺乏时会引发心肌病及心肌衰竭,临床医学证明,威胁人类健康和生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关,如癌症、心血管病、肝病、白内障、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病等,典型的地方

34、性疾病克山病就主要是由于缺硒引起的,通过补硒进行预防和治疗效果很好。因此,专家们建议要每天补充一定量的硒来进行疾病预防和提高免疫力,世界卫生组织建议每天补充200 g硒,2000年中国营养学会制订的中国居民膳食营养素参考摄入量推荐18岁以上者的硒摄入量为50 g/d,适宜摄入量为50-250 g/d,可耐受最高摄入量为400 g/d。海产品、食用菌、肉类、禽蛋、西兰花、紫薯、大蒜等一些食物中含硒较高,如内脏和海产品含硒0.4-1.5 mg/kg,瘦肉0.1-0.4 mg/kg,谷物0.1-0.8 mg/kg,奶制品0.1-0.3 mg/kg,水果、蔬菜0.1 mg/kg。除了天然含硒食品外,营

35、养学家也提倡通过硒营养强化食物补充有机硒,如富硒大米、富硒鸡蛋、富硒蘑菇、富硒茶叶、富硒麦芽、富硒酵母等。但是,补硒不能过量。因为过量的摄入硒可导致中毒,出现皮肤痛觉迟钝、四肢麻木、头昏眼花、脱发、脱甲、胃肠功能紊乱等。每日摄入硒量高达400800毫克/千克体重可导致急性硒中毒,主要表现为运动异常和姿势病态、呼吸困难、胃胀气、高热、脉快、虚脱甚至因呼吸衰竭而死亡。慢性硒中毒往往是由于每天从食物中摄取硒24003000微克,长达数月之久才出现症状,表现为脱发、脱指甲、皮肤黄染、口臭、疲劳、龋齿易感性增加、抑郁等,还可有肝肿大、肝功能异常,自主神经功能紊乱等症状。 硒在人体内的吸收和转化与硒的化学

36、形态密切相关,化学形态不同导致其迁移和转化机制以及在生物体内的代谢途径也不同。无机硒具有含硒量高和价格低廉的优点,但无机硒(如亚硒酸钠)的吸收和利用不很理想,其生物有效性低,最重要的是无机硒毒性较大,中毒量与需要量之间范围很小,因而被严格限制使用。日本早在1993年就禁止在食品和饲料中添加无机硒,美国等发达国家也已经禁止在食品中添加亚硒酸钠等无机硒。而含硒蛋白、硒代氨基酸等有机形态硒虽然含硒量低、价格高,但毒性小,吸收和生物利用率高,目前已被用作硒强化剂广泛应用到各种富硒食品中。 相关国家标准和行业标准都对食品中硒的限量进行了规定,并制定了相应的检测方法。我国现行的国家标准GB 5009.93

37、-2010“食品中硒的测定”和GB/T 21729-2008“茶叶中硒含量的检测方法”均是采用荧光法测定总硒。但目前的方法只能测定总硒含量,无法检测具体的硒化合物形态,无法对毒性较大的无机硒进行科学的管理,因此在食品安全监控上存在很大的漏洞。国外对食品中硒形态的分析已有比较成熟的方法1-8,但国内还没有相关的标准来进行规范。在进出口贸易日趋发达和食品安全形势如此严峻的背景下,急需制定食品中硒形态分析的SN行业标准,采用HPLC-ICP-MS联用新技术,准确测定食品中的硒形态,以适应出入境检验检疫工作发展的需要。三、标准编写规则及编制依据3.1 编写规则 本标准遵循GB/T 1.1-2000 标

38、准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则和GB/T 20001.4-2001 标准编写规则 第4部分:化学分析方法的编写规则。3.2 编制依据 本标准首次制定,没有相关国际标准或者其他标准采用。四、标准制定计划及完成情况 2008年11月,根据国家标准化管理委员会下达检验检疫行业标准第二批制修订计划项目的通知,本单位承担了SN/T 0864-2000进出口酸黄瓜中铝的测定方法行业标准的修定任务。 2008年12月,成立进出口食品中铝的测定方法起草小组,讨论起草方案和分工。 2009年1月3月,开始收集资料文献,购买试剂、耗材、标准品等前期工作。 2009年4月7月,开始建立食品中铝的电感耦

39、合等离子体质谱的测定方法,确定方法测定低限,建立面包、方便面、饼干、酸黄瓜的三水平添加回收及精密度试验。 2009年8月,根据实验数据,起草标准文本和编制说明,完成标准的征求意见稿。 2009年10月,征求意见,并进行汇总,完成标准的送审稿。本标准共发出征求意见稿20份,回函20份其中有意见的为8份,征求系统外单位有3家。 2009年11月12月,完成标准审定及报批工作。五、研究方法和步骤 本方法采用高效液相色谱(HPLC)分离,电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测,对样品前处理提取条件和色谱分离条件进行了优化探讨,检测了食品中的硒酸盐、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸等几种硒化合物形态。5.1 仪器

40、和试剂 高效液相色谱仪,Waters 2695; 电感耦合等离子体质谱仪,X Series2,Thermofisher。5.2 试剂材料 柠檬酸,分析纯; 蛋白酶K,Sigma; 色谱柱:Hamilton PRP X-100 色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m)5.3 标准物质及溶液5.3.1 标准物质 硒酸盐(Selenate,SeVI):标准溶液(GBW10033),75.1g/g(质量浓度,以硒酸根SeO42- 计),中国计量科学研究院; 亚硒酸盐(Selenite,SeIV):标准溶液(GBW10032),68.9g/g(质量浓度,以硒酸根SeO32- 计),中国计量科学研究院;

41、 硒代蛋氨酸(Selenomethionine,SeMet):分子式C5H11NO2Se,CAS No.1464-42-2,纯度99%,Acros organics公司; 硒代胱氨酸(Selenocystine,SeCys2):分子式C6H12N2O4Se2,CAS No. 29621-88-3,纯度98%,Acros organics公司; 硒代乙硫氨酸(Selenoethionine,SeEt):分子式C6H13NO2Se,CAS No. 2578-27-0,纯度98%,TRC公司。5.3.2 标准溶液 准确称取一定量的SeMet标准物质,用去离子水溶解配制成100 mg/L的标准储备液;

42、SeCys2和SeEt用去离子水(加入12滴稀盐酸)分别配制成100 mg/L的标准储备液。5.4 仪器条件5.4.1 色谱条件 Hamilton PRP X-100 色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m);流动相为5 mmol/L柠檬酸溶液(pH 4.5,20%氨水调节),流速1.0 mL/min,进样量100 L。5.4.2 ICP-MS条件 功率:1400 W;冷却气流速:14.0 L/min;辅助气流速:0.8 L/min;雾化气流速:0.85 L/min;H2/He混合气流速:5.8 mL/min;H2/He混合气比例:3:97。5.5 实验步骤5.5.1 色谱分离条件的优化 选

43、择合适的色谱柱和流动相进行分离,对流动相的浓度和酸度进行了优化,确定了最佳的色谱分离条件。5.5.2 检测条件的优化 使用含Li、Be、Co、Ce、In、U、Pb等元素的调谐液调节仪器,使其灵敏度、氧化物、双电荷等各项指标达到检测要求后,采用碰撞反应池技术(CCT)消除多原子离子的干扰和基体干扰,得到最佳的检测结果。5.5.3 提取条件的优化 根据不同硒化合物的性质差异,本方法主要针对食品中的无机硒进行提取和净化。无机硒水溶性很好,一般采用热水或稀酸提取即可。酸提取:将待测样品粉碎后,称取0.51.0 g匀质样品,加入5 mmol/L的柠檬酸溶液20 mL,70 恒温水浴振荡过夜,3 000

44、r/min离心,过0.45 m滤膜,待测,同样方法做试剂空白。酶水解提取:同上称取1.0 g匀质样品,加入20 mg蛋白酶K,再加入20 mL水,37 水浴振荡4 h,3 000 r/min离心,过0.45 m滤膜,待测,同样方法做试剂空白。5.5.4 回收率和精密度 分别采用稀酸提取和酶水解提取考察了方法的加标回收率,其中SeIV、SeVI和SeMet以稀酸提取计算回收率,SeCys2和SeEt以酶水解提取计算回收率。所选取的样品为鲜蘑菇,其中鲜蘑菇中SeCys2、SeIV和SeMet的本底含量分别为0.107 mg/kg 、0.151 mg/kg和0.073 mg/kg,其它形态均未检出。

45、每个加标水平平行测定6次,计算加标回收率和精密度。5.5.5 实际样品检测 选取市售猪肉和蘑菇样品进行检测。六、条件试验和结果6.1 色谱柱的选择 由于硒化合物在水溶液中表现出不同的离子状态,阴离子、阳离子或者两性离子,因此不同的柱子对硒形态的分离效果差别很大,而且如果是易挥发的二甲基硒等,还需要用气相色谱进行分离。本方法在查阅大量资料的基础上,根据我们待测的硒形态种类,选择Hamilton PRP X-100色谱柱进行分离。实验结果发现使用Hamilton PRP X-100色谱柱,采用柠檬酸溶液作为流动相,SeIV、SeVI、SeCys2、SeMet、SeEt 5种硒形态可以良好分离,且流

46、动相配制简单、无毒,适合推广。因此本方法选择使用Hamilton PRP X-100色谱柱。6.2 流动相的选择 流动相性质对色谱分离效果影响很大,形态分析常用的流动相有磷酸铵盐、醋酸铵、柠檬酸等一些弱酸盐。在Se的形态分析中还常用到三氟乙酸、五氟丙酸和七氟丁酸等全氟羧酸9,或者添加烷基磺酸钠、氢氧化四甲基铵等离子对试剂作为流动相成分2,也有加入少量甲醇等有机溶剂来提高有机成分的分离效果9-10。考虑到流动相成份尽量简单、无毒,本实验首先选择了乙酸铵、磷酸二氢铵、柠檬酸等单一溶液作为流动相进行分离,实验发现使用乙酸铵溶液无法将几种形态良好分离(见图1),5种形态只检测到3个色谱峰;使用pH6.

47、0的磷酸二氢铵溶液作为流动相,5种硒形态可完全分离(见图2),但SeVI出峰时间在35min左右(与文献报道相符6),且硒代蛋氨酸的响应信号偏低,原因未知。为了提高检测效率,降低出峰时间,我们试验了改变磷酸二氢铵溶液的浓度和酸度,两种无机硒的保留时间变化很大,甚至与硒代氨基酸的峰发生重叠,但是在优化的分离条件下,不仅硒代蛋氨酸的检出限没有改善,而且重复性较差,因此磷酸二氢铵溶液不是理想的流动相。使用柠檬酸溶液作为流动相,在优化的条件下,SeVI出峰时间在10min左右,SeEt出峰时间不变,基本维持在18分钟左右,5种硒形态完全分离(见图3),重复性和线性相关系数都很好。因此,本实验选择使用柠

48、檬酸溶液作为流动相。图1. 硒形态分离色谱图,流动相:乙酸铵图2. 硒形态分离色谱图,流动相:磷酸二氢铵图3. 硒形态分离色谱图,流动相:柠檬酸6.3 流动相酸度的影响 在不同的pH条件下,各形态硒化合物的分离度不同,因此不同形态硒化合物在水溶液中表现出不同的离子状态,阳离子、阴离子或者两性离子2。硒酸(pK2 1.7)和亚硒酸(pK1 2.46,pK2 7.31)在水溶液中以带一个或者两个负电荷的阴离子形式存在,在pH4时,一部分亚硒酸可能未发生离解。硒代胱胺在低pH值时可能带两个正电荷,在高pH值时可能以中性分子存在,这种化合物的解离常数目前来讲是未知的。硒代蛋氨酸(pK1 2.19,pK

49、2 9.05)和硒代乙硫氨酸在低pH值的水溶液中以阳离子形式存在(羧基基团不去质子化也不解离,氨基酸基团质子化并带正电荷),在中等强度pH值的溶液中以两性离子存在(羧基基团去质子化带负电荷,氨基酸基团质子化并带正电荷),在高pH值的溶液中以阴离子形式存在(羧基基团去质子化带负电荷,氨基酸基团不去质子化不带电荷)。硒代乙硫氨酸的解离常数未知,但被认为与硒代蛋氨酸的解离常数基本一致,因为蛋氨酸(pK1 2.23,pK2 9.08)和乙硫氨基酪酸(pK1 未知,pK2 9.02)等相应的含硫氨基酸,有非常相近的解离常数。根据解离常数pK值的不同,在水溶液中可能存在5种硒代胱氨酸(pK1 1.68,p

50、K2 2.15,pK3 8.07,pK4 8.94)离子状态。在非常低的pH条件下,硒代胱氨酸带两个正电荷(两个质子化的氨基酸基团),在低pH条件下带一个正电荷,在中等pH条件下以两性离子存在,在较高pH条件下带一个负电荷,在更高pH条件下转变为带两个负电荷的阴离子。因此阳离子硒形态、阴离子形态和两性化合物形态可能同时存在于水溶液中,流动相酸度的变化对他们的分离是一个巨大的挑战。 实验发现,不同酸度的流动相导致出峰顺序变化很大,主要是酸度对无机硒的保留时间影响太大,在高pH值条件下,SeVI在SeEt后出峰(见图4a),而随着酸度的升高(pH值降低),硒酸盐的保留时间急剧减少,同时亚硒酸盐的保留时间也有所减少,而硒代氨基酸的保留时间则基本没有影响。图4显示了不同酸度条件下5种硒形态的分离效果。图4 不同酸度条件下硒形态的分离色谱图。流动相浓度均为5mmol/L柠檬酸溶液,图中a、b、c、d、e所对应的pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,各色谱峰依次为:1. SeCys2;2. SeIV;3. SeMet;4. SeVI;5. SeEt6.4 流动相浓度的影响 酸度相同的条件下,不同浓度的流动相对保留时间影响也很大。随着流动相浓度的升高,无机硒的保留时间减少,特别是SeVI