水稻几丁质酶定向进化

1、i分类号： 067 密级： 公开硕硕 士士 研研 究究 生生 学学 位位 论论 文文论文题目： 水道稻几丁质酶的定向进化 专 业： 生物化学与分子生物学 研究方向： 植物分子生物学 研 究 生： 袁卫生 指导老师： 刘红全 副教授 论文起止日期 2011 年 5 月至 2013 年 6 月iiiii水稻几丁质酶的定向进化水稻几丁质酶的定向进化研究研究摘摘 要要利用易错 pcr 和 dna 改组对水稻几丁质酶基因 chab 进行随机突变。将突变基因产物克隆到分泌型表达载体 pmbp-p，并导入感受态 e.coli top10f构建突变体文库；利用几丁质平板法筛选到了突变体 cha-p。通过正交试

2、验优化得到 cha-p 重组蛋白的最佳表达条件：ph6.5，iptg浓度 0.8mm，33，200rpm，培养 5h；cha-p 胞外酶活力为 80umol/min, 较野生酶活力提高了 2 倍。重组蛋白主要以包涵体形式存在。运用尿素梯度透析复性法对包涵体进行复性，复性后的酶比活力为 0.24u/mg。对突变体进行序列分析发现：cha-p 的核苷酸序列较野生几丁质酶核苷酸序列发生了 318 位 ct，368 位 ag，374 位 ag 三个碱基的改变，相应的氨基酸序列发生了天冬氨酸甘氨酸（123 位 dg） ，酪氨酸半胱氨酸（125 位 yc）的改变。在突变序列中也发生了一段 (4 位-129

3、 位) 碱基缺失和插入 (736 位-768 位)，插入使得终止密码子提前出现，造成蛋白质翻译的提前终止。关键词：关键词：几丁质酶 易错 pcr dna 改组 定向进化 酶活 ivdirected evolution of rice chitinase abstractrandom mutagenesis on rice chitinase gene chab was conducted by using error-prone pcr and dan-shuffing strategythe mutation product was recombinated in expression ve

4、ctor pmbp-p, and transformed into e.coli top10f to construct the mutant library. the mutant strain cha-p was selected using the method of chitin plate. the optimal expression conditions of the mutant cha-p recombinant protein were obtained by orthogonal test which involve: 0.8mm iptg induction, the

5、ph of the medium is 6.5, oscillate fermenting 5h with 200rpm and 33. cha-p extracellular enzyme activity is 80umol/min, which increased twice times compared with that of the wild-type enzyme. the recombinant proteins mainly existed in inclusion bodies. the inclusion bodies were refolded by urea grad

6、ient dialysis refolding method. the enzymatic activity of the renatured recombinant proteins is 0.24u/mg. sequence analysis of the mutant cha-p showed that three nucleotides substitution 318c/t，368a/g and 374a/g occurred，and caused two amino acids mutation of 123d/g and 125y/c. furthermore, the muta

7、tion includes the absence of 126 bases (4 to 129) and 2 bases insertion (736 to 738), which makes the termination codon appeared in advance, and causing premature termination of the protein translation. keywords: chitinase; error-prone pcr; dna shuffling; directed evolution; enzymatic activity目目 录录1

8、 1 前言前言 .1 11.11.1 植物几丁质酶特性植物几丁质酶特性 .1 1v1.21.2 植物几丁质酶的分类植物几丁质酶的分类 .2 21.31.3 植物几丁质酶基因研究进展植物几丁质酶基因研究进展 .2 21.3.11.3.1 几丁质酶新发现几丁质酶新发现 .2 21.3.21.3.2 几丁质酶几丁质酶 n-n-端研究端研究 .3 31.3.31.3.3 几丁酶农业上应用几丁酶农业上应用.4 41.41.4 问题与展望问题与展望.4 42 2 定向进化定向进化 .6 62.12.1 易错易错 pcrpcr.7 72.22.2 dnadna 改组改组.7 72.32.3 筛选方法筛选方法

9、 .8 82.42.4 定向进化的应用定向进化的应用 .9 92.4.12.4.1 工业领域研究工业领域研究 .9 92.4.22.4.2 药用蛋白领域研究药用蛋白领域研究.9 92.4.32.4.3 农业领域研究农业领域研究.10102.52.5 定向进化应用前景定向进化应用前景 .10102.62.6 研究的目的和意义研究的目的和意义 .11113 3 目的基因的体外突变及克隆目的基因的体外突变及克隆.12123.13.1 实验材料实验材料.12123.1.13.1.1 菌株菌株 .12123.1.23.1.2 质粒质粒 .12123.1.33.1.3 试剂试剂 .12123.1.43.1

10、.4 主要仪器主要仪器 .12123.23.2 实验方法实验方法 .13133.2.13.2.1 几丁质酶基因突变及筛选文库的构建几丁质酶基因突变及筛选文库的构建 .13133.2.1.13.2.1.1 质粒提取质粒提取 .13133.2.1.23.2.1.2 水稻几丁质酶基因水稻几丁质酶基因chabchab的扩增的扩增 .13133.2.1.33.2.1.3 目的基因纯化回收目的基因纯化回收 .13133.2.23.2.2 易错易错 pcrpcr.14143.2.33.2.3 dnadna 改组改组(dna(dna shuffling)shuffling) .14143.2.43.2.4 突

11、变文库的构建突变文库的构建.14143.2.4.13.2.4.1 新鲜感受态细胞的制备新鲜感受态细胞的制备.15153.2.4.23.2.4.2 限制性酶切限制性酶切.15153.2.4.33.2.4.3 连接连接.15153.2.4.43.2.4.4 转化转化 .1515vi3.2.53.2.5 筛选筛选 .16163.2.63.2.6 序列分析序列分析.16163.33.3 结果分析结果分析.16163.3.13.3.1 质粒提取及质粒提取及 pcrpcr 鉴定鉴定 .16163.3.23.3.2 体外突变体外突变 .17173.3.2.13.3.2.1 易错易错 pcrpcr 结果结果

12、.17173.3.2.23.3.2.2 dnadna shufflingshuffling 结果结果 .17173.3.33.3.3 突变文库鉴定突变文库鉴定.19193.3.43.3.4 序列分析结果序列分析结果.19193.43.4 讨论讨论.21213.4.13.4.1 易错易错 pcrpcr.21213.4.23.4.2 dnadna shufflingshuffling.21213.4.33.4.3 突变表达载体构建及筛选突变表达载体构建及筛选.22224 4 重组菌的诱导表达及酶活力测定重组菌的诱导表达及酶活力测定 .23234.14.1 材料及试剂材料及试剂 .23234.1.1

13、4.1.1 菌种菌种.23234.1.24.1.2 主要试剂与溶液主要试剂与溶液.23234.1.34.1.3 主要仪器主要仪器.23234.1.44.1.4 胶体几丁质的制备胶体几丁质的制备.24244.1.54.1.5 dnsdns 的配制的配制 .24244.1.64.1.6 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 g-250g-250 的配置的配置.24244.24.2 实验方法实验方法 .24244.2.14.2.1 几丁质酶活测定几丁质酶活测定.25254.2.1.24.2.1.2 氨基葡萄糖标准曲线的绘制氨基葡萄糖标准曲线的绘制.25254.2.2.24.2.2.2 几丁质酶活测定几丁质酶活测定.

14、26264.2.24.2.2 蛋白质含量测定蛋白质含量测定.26264.2.2.14.2.2.1 蛋白含量标准曲线的绘制蛋白含量标准曲线的绘制.26264.2.2.24.2.2.2 可溶性蛋白含量测定可溶性蛋白含量测定 .27274.2.34.2.3 菌体沉淀菌体沉淀 sds-pagesds-page 电泳鉴定电泳鉴定 .27274.2.44.2.4 cha-pcha-p突变体的诱导表达突变体的诱导表达 .28284.2.4.14.2.4.1 cha-pcha-p突变体表达条件优化突变体表达条件优化 .29294.2.54.2.5 包涵体复性包涵体复性.30304.2.5.14.2.5.1 包

15、涵体的溶解包涵体的溶解.30304.2.5.24.2.5.2 包涵体复性包涵体复性 .3131vii4.34.3 结果分析结果分析.31314.3.14.3.1 突变体突变体cha-pcha-p诱导表达结果诱导表达结果 .31314.3.24.3.2 cha-pcha-p突变体表达条件的正交优化突变体表达条件的正交优化 .33334.3.34.3.3 包涵体复性结果包涵体复性结果.36364.44.4 讨论讨论.37374.4.14.4.1 突变体突变体cha-pcha-p的诱导表达的诱导表达 .37374.4.24.4.2 表达条件优化表达条件优化 .38384.4.34.4.3 可能形成的

16、包涵体原因可能形成的包涵体原因 .38384.4.24.4.2 包涵体的处理及复性包涵体的处理及复性 .38385 5 小结小结 .4040参考文献参考文献.4141致致 谢谢.474701 前言前言甲壳素或甲壳质又称为几丁质，它是由 n-乙酰-d-氨基葡萄糖以 -1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物1。几丁质广泛存在于水生甲壳类动物、软体动物和节肢动物外壳中，如虾、螃蟹等，同时也是大多数真菌细胞壁的主要成分，也存在于一些绿藻中。其在地球上的含量非常丰富，仅次于纤维素，而它又具有比纤维素更加丰富的功能性质。可广泛应用在医药、化工、食品、环境等许多领域。每年自然界中产生数量极其巨大的几丁质，几丁质

17、及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源，它们参与生态系统的物质交换和能量流动2。几丁质酶是一种能催化降解几丁质的糖苷酶，主要是水解几丁质中 -1，4 糖苷键,产生几丁质单糖-n-乙酰氨基葡萄糖（nag） 。很多植物都可以合成不同的几丁质酶，对于植物几丁质酶来说内源性底物尚未发现，但植物几丁质酶也参与植物与微生物之间的相互作用，从而产生几丁质及其相关的混合物。由于几丁质是很多病菌细胞壁和害虫等生物体的组成成分，所以几丁质酶能通过水解几丁质从而抵御病原菌和害虫的入侵。目前已经从许多微生物中分离到几丁质酶，并全面了解了其中一些几丁质酶的体外水解能力及对温度、ph 耐受等生物学性质。尤其是真菌几丁质酶在

18、转基因植物中的应用，对真菌病原菌表现出了较好的抑制作用，降低了病原菌所产生的减产危害。这表明微生物几丁质酶在农业生产中将起到重要作用。当然几丁质酶还有其它的一些重要作用,如抗冻害3、植物发育调节4、生物固氮5等方面都发挥着重要的作用，并与人类有些疾病发生相关6，7、广泛参与了植物光合作用等过程8。几丁质酶水解几丁质后获得的具有生物活性氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着重要的作用，其作为植物功能调节剂，不仅可以调控植物基因表达的开放与否，还可以诱导植物产生抗性蛋白质，调节植物的生长和提高植物对病原微生物的防御能力。这些研究均暗示着几丁质酶具有多种生理功能，可应用领域十分广泛。目前对几丁质

19、酶的特性、基因结构、分类、分子进化、生物学作用及转几丁质酶基因的研究越来越深入，近年来已成为作物抗真菌病害的研究热点之一。1.1 植物几丁质酶特性植物几丁质酶特性大多数植物几丁质酶的分子量为 15-55kd，最适 ph 为一般低于 7，对温度相对稳定；等电点有的偏酸，有的偏碱，所以有酸性和碱性几丁质酶之分,植物1体内通常含有 1 种或几种几丁质酶9。植物几丁质酶的产生主要有组成型的和诱导型。正常情况下，植物几乎不表达几丁质酶，极少数植物会表达几丁质酶但含量很低。当植物受到卵菌、真菌、细菌、病毒和害虫等外来侵害时，植物可以产生大量的不同防御性相关蛋白质（pr）来抵御。特别是在植物被感染的部位 p

20、r 含量会明显增加，含量可提高到原来的十几倍甚至几百倍，从而避免植物遭受某些真菌、病毒等的侵害，但这种反应对病原菌和害虫抑制效果并不明显。水杨酸、茉莉酸、乙烯、-葡聚糖低聚糖、几丁质、壳聚糖寡糖和脂多糖等信号分子也能分别诱导植物产生防御相关蛋白10-11。 几丁质酶可以水解几丁质中的 -1,4 糖苷键，将 2-乙酰氨基-2-脱氧-d-葡萄糖线性多糖水解成甲壳低聚糖。1.2 植物几丁质酶的分类植物几丁质酶的分类在 cazy 数据库中，根据几丁质酶的氨基酸序列将植物几丁质酶归类到gh18 和 gh19 家族中12。这两个家族的酶存在不同的催化反应机制，在进行水解反应时，gh18 家族几丁质酶利用底

21、物辅助催化，导致异构体的零捕获量13。gh19 家族几丁质酶利用一种反向催化机制，其中的两个酸性氨基酸残基催化反向异构水解反应14。gh18 几丁质酶的催化区域是一个由（/）8 组成的桶状折叠结构，而 gh19 几丁质酶的催化区域则有是由 -螺旋构成的。据报道，按照它们的分子组成，植物几丁质酶至少分成五类，classes i，ii和 iv 几丁质酶含有 gh19 家族的催化区域。classes i 几丁质酶有三个功能区组成：富含半胱氨酸 n-端几丁质结合区，富含脯氨酸(pro)、甘氨酸(gly)、精氨酸(arg)的可变交联区，高度保守的 c-端催化区。class iv 的催化区域小于 clas

22、ses i 和 ii，其中 classes i 和 iv 在 n 端含有碳水化合物结合模块。classes iii 和 v含有 gh18 家族的催化区域，但 class v 的催化区域比 classes iii 的催化区域大；classes iii 缺少几丁质结合区且该酶催化区的序列与 classes i 有很大差别，classes v 几丁质酶在 n 端有一个重复的几丁质结合区。classes i 和 iv 在 n 端有富含半胱氨酸的几丁质结合区（cbd），但 classes iv 在催化区域发生了四个氨基酸残基缺失，且与 classes i 催化区的同源性较低。classes ii 缺少

23、cbd区和交联区，但它的催化区和 classes i 该功能区极为相似。几丁质结合区虽然不是催化能力和抗菌活性必不可缺少的，但其能增加抗菌效果15。21.3 植物几丁质酶基因研究进展植物几丁质酶基因研究进展1.3.1 几丁质酶新发现几丁质酶新发现自 brogue16等 1991 年首次报道菜豆几丁质酶转基因烟草植物提高立枯丝核菌(rhizoctonia solani)的抗性以来，植物几丁质酶基因常作为抗病基因转入受体植物以提高对目的病原真菌的抗性。植物和细菌的几丁质酶对真菌有抑制能力这一事实很早就已被人们所知17，18，但任何单一的植物或细菌产生的几丁质酶都不能表现出合适的抗菌能力。kana

24、ishisak19等人对猪笼草分泌液中 class iv 几丁质酶研究发现在其活性位点有 5 个亚位点，这些位点对(glcnac)n 的水解反应是有利的，但对于高聚底物分子没有作用。催化(glcn- ac)n（n=4 或5）的水解反应中检测到底物抑制现象。这对于研究猪笼草分泌液中几丁质酶的作用来说是一个很重要的发现。shaoyun wang20等人从蚕豆的种子获得的一种新型的几丁质酶，对其抗菌性和热稳定性的研究发现：该酶对菜豆绵腐病菌, 香碗豆萎凋病菌，苹果粗皮病菌，互隔交链孢霉,葡萄孢菌和镰刀菌都有抑制作用；在 20，30，40，50和 58保持 10min，该酶仍保持很高的生物活性。这表明

25、该酶在农业生产中有着重要的抗真菌能力。haixia yang21等人从石榴种子中分离纯化得到一种新的有很强钙离子结合能力的几丁质酶。经免疫组化和免疫印迹分析发现这种几丁质酶不像已发现的几丁质酶那样定位于内质网或液泡内，而是存在于石榴种子的造粉体间质中。通过对等电点聚焦实验及氨基酸序列研究结果表明该酶的等电点为 4.41；有类似 18 家族的两个保守区域，序列中富含天冬氨酸和谷氨酸，含有 21 个天冬氨酸残基,是目前已知的 class中最多的一种几丁质酶，信号肽序列中含有很高比例的疏水性氨基酸。研究发现该酶在种子的发芽过程中起着重要作用,钙离子有利于蛋白三级结构稳定,且不影响酶的活性。1.3.2

26、 几丁质酶几丁质酶 n-端研究端研究naoyuki umemoto22等人对来自于烟草的 class v 几丁质酶，通过定点突变法将位于底物结合区的色氨（trp326）突变成丙氨酸和苯丙氨酸后，该酶的热稳定性降低了 5-7，催化活力显著降低。这说明了 trp326 残基对于蛋白质结构方面起着很大作用，且在 glu115 作为质子供体提供的水解环境存在时对于保持稳定催化活力方面也可能起到一定的增强作用。lysm 是一个由 45 个氨基酸组成的蛋白功能区，最初在少数几种细菌自溶蛋白质中被发现。shoko onaga23等人在琉球凤尾蕨类中发现了 prchi-a 这种新的几丁质酶，该酶属于class

27、es iii 类，n-端有两个 lysm 功能区域，其几丁质结合能力及抗菌特性研究3表明 prchi-a 是主要通过 lysm 实现几丁质的结合，lysm 虽然没有催化活力，但却有利于提高植物的抗菌能力。1.3.3 几丁酶农业上应用几丁酶农业上应用目前，在植物抗病基因工程研究中，几丁质酶基因主要应用于 3 个方面：1）把其它来源的几丁质酶基因导入寄主植物中, 以提高寄主植物几丁质酶的表达水平。2）改造植物原有的几丁质酶基因，改换强启动子、导入增强子等，以增加几丁质酶基因的表达量。 3）改造野生生防菌株，通过转基因，使生防菌株获得新的抗病机制。多年的研究结果表明24,25,26,27，不仅单独转

28、化植物几丁质酶基因可获得对病原真菌抗性提高的转基因植株, 而且与其他抗菌蛋白基因如-1，3-葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因等共转化，可产生协同作用而对病原真菌抗性进一步增强, 研究结果促进了不同植物来源几丁质酶基因的挖掘和利用价值评价。朱荷琴28等将几丁质酶和葡聚糖酶基因导入抗黄萎病性较差的受体（中棉所 24），获得的转基因株系 61217-1 抗黄萎病性极显著提高，达抗病水平，且能稳定遗传。苦瓜几丁质酶基因 mcchit1 基因具有广谱抗菌性,张长伟29等将其遗传转化水稻，采用“逐代增加选择压,抗中选抗”的方法，筛选出了稻瘟病抗性优良、抗谱明显拓宽、产量性状较好的转基因稳定株系。木霉菌产生

29、的几丁质酶在相同的条件下表现出的抗菌能力比目前任何其它来源的几丁质酶抗菌能力都强，木霉菌产生的几丁质酶抗菌范围也更广 30。g v s saiprasad31等人利用来自木霉菌的内切几丁质酶基因在 camv35s 启动子的控制下成功导入烟草中，转基因烟草对木霉菌表现出了显著的抑制作用。linus moses kosambo-ayoo32等人将源自哈茨木霉菌的几丁质酶基因和壳聚糖酶基因同时转入高梁基因组中，成功地获得了对炭疽病有抵抗作用的转基因高梁，从而可以有效降低炭疽病所导致的高梁减产程度。1.4 问题与展望问题与展望植物疾病对全世界范围内的农业都是一个巨大的挑战，含有几丁质酶等病程相关蛋白质

30、的转基因作物可以增强植物抵抗病菌的入侵能力，所以转基因作物的大面积种植被看作应对这一挑战的有效方法。虽然近几年，越来越多转基因植物表现出了抗真菌活性，一些含有抗病虫的转基因植物体内的几丁质酶的活性得到了提高，但这些转基因植物却没有表出相应的抗菌能力。例如，转基因烟草体内虽然几丁质酶的活性得到了显著的4提高，但却对生活在其根际的病原真菌没有抵抗能力33。在 arlorio 等34进行的研究发现水解酶对于外生菌根和石楠菌根真菌没有抑制作用。有两种可能可以解释几丁质酶对于不同的真菌表现出不同的抗性作用。第一，可能是由于不同的真菌的细胞壁所含的几丁质的比例不同：那些细胞壁中几丁质所占比例低的真菌，不易

31、被几丁质酶发现。第二，可能是在不同的真菌细胞壁几丁质中暴露出的对几丁质酶敏感的键，存在很大的不同：如果几丁质敏感键暴露的较少，那么真病原菌就不会及时地受到几丁质酶的水解。当然几丁质酶在植物体内的表达水平和定位情况也对其能否发挥抗菌性起到很重要的作用。例如，碱性几丁质酶定位于植物的液泡中，不可能对生活在细胞间的丛枝菌根真菌起到抑制作用35。因此，即使在丛枝菌根真菌侵染的植物根部几丁质酶水平得到提高也不影响其在根部的生存。伴随着水解酶在植物体内持续高水平的表达，丛枝菌根真菌也许已经适应了那些水解酶的存在，已经发现其它的真菌在水解酶存在仍能生存的情况36，37。随着对几丁质酶作用机理研究的深入，通过

32、几丁质酶基因工程手段培育出具抗性转基因植物将成为防治植物真菌病害的有效途径。又因其不污染环境、不产生抗药性、基因稳定遗传和对病虫害的抑制作用等特性，所以扩大转入几丁质酶基因植物群体，将成为今后转入几丁质酶基因植物实用化的主要方向38。52 定向进化定向进化体外随机突变已经成为在产生优化酶或有特定功能蛋白质的常用策略。该策略包括对编码不同蛋白基因的体外突变，突变蛋白质的表达及基于目的特性的蛋白质筛选两个部分。 事实上蛋白质体外定向进化并不是一个新的概念，早在上世纪 70 年代有关蛋白质定向进化就已经有了比较系统的研究。定向进化一个早期例子是来自大肠杆菌的 ebga 酶蛋白，该酶缺少-半乳糖苷酶活

33、性。通过多次筛选以乳糖为唯一碳源的 lacz 缺少的大肠杆菌株系，结果表明筛选到的野生型 ebga 酶蛋白进化成了具有 -半乳糖苷酶活性，从而替代了 lacz 基因的功能39。蛋白质定向进化是一个用来描述产生突变体和筛选期望特性的突变技术。在过去三十年里，蛋白质定向进化已经发展成为蛋白质工程中的一个强大有力的技术平台。该技术有效地利用分子生物学工具和高通量筛选技术已经取得了巨大的进步。这些方法简化了实验过程并促进了突变体的筛选鉴定，即使这些突变体在期望特性发生微小的提高。进一步发展的 dna 重组技术可以用于单结构基因或基因的突变，从而为快速生长或高水平表达蛋白质找到一个合适的替代宿主。此外，

34、如易错 pcr 可以通基因的插入或缺失控制突变率进行蛋白质修饰。定点突变、定点饱和突变和合成寡核苷酸也能被用于扩大氨基酸的多样性。虽然突变体的功能互补在筛选突变体仍然是一种极好的选择，但目前随着仪器设备灵敏度及许多化学和生物学分析的微型化的不断发展，可以依据目的特性大量的筛选样品。快速获得基因突变体 dna 序列信息的能力不仅使我们更深刻的理解蛋白质序列和功能之间的关系，而且增强我们选择最好策略进行特定蛋白质进化的能力。一个最有效的蛋白质定向策略是逐渐的累积重组突变，同时运用高通量筛选，该策略主要难点在于：突变频率的控制和筛选方法的选择。如果突变率过高会增加形成无义或有害突变的机率，而突变率较

35、低则不能起到突变的效果；经定向突变后所形成的突变体文库一般的容量都比较大，给筛选工作带来不便；所以对于定向进化来说，突变率的控制和高通量筛选方法选择决定着该策略能否成功。蛋白质定向进化不需要事先了解基因表达产物的三维结构，就可对目6标蛋白达到改造的目的，所以其应用也越来越广泛。体外分子进化技术主要有易错 pcr、dna shuffling、外显子改组、随机引物体外重组法、定点饱和突变法、交错延伸重组、瞬时模板随机嵌合生长等策略40。随着分子生物学技术的发展，通过体外分子进化，可以更快速、灵活和简便的改造目的基因。从功能出发，获得某些优化的突变体，一方面可快速将其推向实际应用，另一方面将对蛋白质

36、的理论研究起到更大的促进作用41。2.1 易错易错 pcr易错 pcr 是使用最广泛的体外突变方法之一，常用于诱导形成突变体的一种随机突变方法，已经成为蛋白质工程中有效工具。经典的易错 pcr 是通过改变反应体系中各组成成分的浓度、外加一定浓度的 mn2+及改变反应体系中所使用的聚合酶（没有 3到点 5的外切酶活性），从而导致扩增出的 pcr 产物发生碱基错配。但经典的易错 pcr 方法中由于所用的 taq/pfu 聚合酶没有校对功能，所以产生的突变存在 atgc 转换和 atta 颠换的倾向，为了弥补这个主要缺陷日本学者 toshifumi minamoto 42等探索出了一种新的易错 pc

37、r 方法：使用重水代替普通的双蒸水作为反应体系中的溶剂。他们通过选择（a) 100% h2o, (b) 100% h2o/0.6 mm mn2+, (c) 99% d2o, (d) 99% d2o/0.6 mm mn2+ 和(e) 99% h218o 五种不同的条件进行 pcr 扩增研究发现：使用重水作为溶剂时易错pcr 产生的突变没有位置偏好性，模反依赖性或发生产物减少的现象。一般适合较小的基因片段(1000bp)，但也有报道可以用来扩增几千 bp 基因片段。随着研究不断的深入相继出了以易错 pcr 技术为基础的体外突变技术，如重叠延伸蛋白域文库法，该方法是 jose 等43于 2008 年

38、首次提出的，其利用易错 pcr 技术引入一个随机片段，并且在相应的氨基酸序列上做标记，用高保真pcr 扩增上游不被改变的具有一定功能的脱氧核糖核苷酸序列，该序列中的部分序列与被引入的随机片段重叠后进行杂交延伸反应，产生新的核苷酸序列可以用于构建突变克隆文库。这种方法提高了易错 pcr 的突变效率，能够在一个特定的区域发生随机突变，也就是说可以在预期的区域进行随机突变。所以，当涉及到多域蛋白质的突变时，重叠延伸蛋白域文库法是首选的方法。重叠延伸蛋白域文库法与易错 pcr 和 dna 改组44相比，有重大的提高。该方法的不足是步骤较繁锁，突变效率有限。2.2 dna 改组改组dna 改组是 ste

39、mmer 等45 于 1994 提出来的，该技术是通过对一组序列相关的 dna 序列经超声波处理或在 dnasei 的作用下随机酶切成小片段，然后7在不加引物的情况下，采用有性 pcr 方法进行合成；随着循环数的增加，pcr产物将越来越接近切割前目的基因的长度；最后，用基因两侧的引物合成全长的基因。图2.1 dna改组流程研究表明，dan 改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生 1%的良性突变，但 dna 改组可产生 13%的良性突变。而且，dna 改组还可引入可控制水平的点突变(0.05%-0.7%) ，其所产生的突变基因库容量远远高于随机突变所产生的点突变库容量46。在 dn

40、a 改组出现以前，寡核苷酸定向诱变和易错 pcr 被广泛用于对蛋白的体外突变，一段时期以来在工业，医药等领域却也有着广泛的应用，尽管这两种方法只发生了较低的点突变。通过突变或重组获得基因文库的多样性，一般出发基因突变文库利用点突变（如易错 pcr）或定点突变产生；因为有益突变一般相对于不利突变产生的频率要低很多，只有单个有益突变在每轮突变循环中累积并不断被筛选出。事实上，当产生多突变后，目标蛋白特性发生改善的机率则迅速降低；因此通过几轮点突变方法产生蛋白质特性提高是有限且较小的。dna 改组通过引入来自多基因的有益突变定向重组，从而克服了点突变的局限性，相继出现了 whole-genome s

41、huffling、dna family shuffling、随机链交换突变法，其中随机链交换突变法是 ryota47，48等于 2006 年首次提出的，该方法除了需要在小片段的 3端用末端脱氧转移酶（tdt）随机的加入 1-5bp 碱基外，其余均与 dna shuffling 步骤几乎一致，但与 dna shuffling 相比，不需8要一组含点突变的基因或基因家族，可直接以单个基因为父本，而且它产生的突变强度大于 dna shuffling，包含点突变、区域交换外，还可以产生随机序列的插入或删除等，从而提高突变文库的多样性47。2.3 筛选方法筛选方法在完成构建突变文库之后最重要的是根据所要

42、得到的特性选择合适的筛选模型进行筛选。合理的高通量筛选方案对于定向进化的最终成功至关重要。筛选方法选用应按照以下标准：第一，对要筛选目的蛋白质具有针对性，所筛即所得，这也被称为定向进化第一定律。第二，必须是高通量的筛选方法。第三，检测方法必须具有可行性，检测过程具有一定的灵敏度。目前通常采用的筛选方法是基于生物学表型的筛选，例如对抗生素抗性的基因进行定向进化，只需在提高抗生素浓度的平板上即可进行高效筛选；改造编码耐热酶基因的过程，通过提高培养温度就可以筛选耐热性提高的酶。生物学表型筛选方法一般简单有效，但也有其一定的局限性，例如对于不能通过生物学表型鉴定的性状就不能通过生物学表型方法筛选，因而

43、出现了许多新的筛选方法以应对各种复杂的性状49。如：流式细胞分选技术、酵母表面展示技术、噬菌体展示技术、mrna 展示技术，其中酵母表面展示技术作为一种真核蛋白质系统，近年来已经越来越多的应用于酶、医药卫生、食品，生物燃料等方面。其基本原理是：利用外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母菌细胞内，通过该细胞内的蛋白质转运至膜表面的机制使目标蛋白质固定化表达在细胞表面50。2.4 定向进化的应用定向进化的应用2.4.1 工业领域研究工业领域研究赵心清51等利用易错 pcr 对酿酒酵 4126 的 spt3 进行体外突变，筛选到了对高浓度乙醇耐受性提高的突变株 m25，该突变株利用 125

44、g/l 的葡萄糖进行乙醇发酵时，终点乙醇产量比对照菌株提高了 11.7。 氢气是一种有很大应用前景的可替代能源,生物体内可以合成释放出氢气，其中荚膜红细菌就是这类生物体，但该菌产氢气的能力及对温度的耐受点低。 abdulmecit 52等人利用体外定向进化手段获得了几株乙基甲烷磺酸(ems)发生突变的荚膜红细菌突变体。对其氢气产量和耐热能力鉴定发现：突变后氢气产量较未突变前提高了24%，42时依然很稳定，这表明定向进化是一种非常有用的方法对于提高工业微生物某些重要性质方面。92.4.2 药用蛋白领域研究药用蛋白领域研究定向进化可以用来优化药用蛋白，提高药用蛋白临床上的应用价值。目前体外定向进化

45、技术也被广泛的应用于改造细胞因子和生长因子、提高抗体表达水平、改变抗体的亲和性，在新型疫苗和药物分子上也有很大突破性研究53-57。chang 等以多种人-inf基因为底物进行 dna 改组，经两轮改组筛选后得到的大多数突变体的活性较野生型提高了 285000 倍，其中有三个突变体的活性是小鼠自身活性最高的 3.5 倍56。囊性纤维化病是一种与胰腺机能不全有关的疾病，管腔内酸性条件限制了胰腺酶替代治疗的作用，尤其是脂肪酶的影响。damien 58等人运用定向进化与合理的设计来提高人类胰腺酶在酸性条件下的催化能力。筛选出了在低 ph 值条件下仍有活性的突变体。经过一轮随机突变产生了一个在酸性培养

46、基条件下活性提高 50%的脂肪突变体，该突变体带有一个长链的三酸甘油脂。序列分析发现在特定区域发生了两个碱基替换，疏水沟定位在三酸甘油脂的 sn-1 上。其表面上的环可能是脂肪酶/辅脂肪酶与脂质相互作用的媒介。有趣的是前面的两个替换改变了脂肪酶朝向介质和长链三酸甘油脂的链长度。他们的研究结果为设计在酸性条件下催化活性提高的脂肪酶提供了支持，并首次证明了与特定链长有关的重要残基。2.4.3 农业领域研究农业领域研究甘蔗巨型螟是一种严重危害甘蔗的害虫，其内生的生活方式大大降低了化学和生物控制的效果。kilvia 59等人利用 dna shuffling 对 bacillus thuringiens

47、is cry 蛋白质基因进行体外突变，并通过噬菌体展示，筛选到了对甘蔗巨型螟产生毒性的突变体，这一研究对于通过转基因方式来控制甘蔗巨型螟的入侵有重要意义。植物液泡 na+/h+反向转运子在维持细胞离子动态平衡和调节转运细胞质内的 na+到液泡内起重要的作用。虽然液泡反向转运子在耐盐方面起着重要作用，但 na+/h+反向转运子相对较低的交换 na+/h+的 vmax 被证明限制了耐盐作物分子育种的实施。徐凯60在研究中运用 dna 改组产生和重组了拟南芥液泡na+/h+反向转运子 atnhx1 基因的突变体。运用大型酵母互补系统筛选，证明了 atnhxs1 是一个新的 na+/h+反向转运子。a

48、tnhxs1 在酵母表达证明这个新的反向转运子定位在液泡的膜上，它的表达提高了酵母对 nacl，kcl，licl 和潮霉素 b 的耐受能力。通过测定完好酵母液泡转运离子的能力证明 atnhxs1 蛋白表现出了较高的 na+/h+交换能力，并且它交换 k+/h+的能力也有轻微的改善。102.5 定向进化应用前景定向进化应用前景由于许多蛋白质的结构以及结构和功能之间的联系尚未弄清，因此定向进化技术在蛋白质工程领域拥有巨大的优越性，它能在很短的时间内完成自然界上百万年的进化历程，在改造蛋白质分子特性方面应用越来越广泛，新的、更好的蛋白质定向进化技术也在不断出现。如今，定向进化技术已被广泛用于基因的体

49、外进化，出现了一系列具有重要工业意义或商业价值的基因和蛋白，大大加速了基因的进化进程，在农业、石油化工、生物工程、人类基因治疗研究等重要领域具有广阔的应用开发前景。2.6 研究的目的和意义研究的目的和意义几丁质酶在植物病虫害防治方面所具有的利用价值，已经引起人们的普遍重视，农业害虫及某些真菌病原体内存在几丁质酶，它们通过几丁质酶调节自身的生理生长过程，保证正常生长及生活，但必需是在合适的时间产生适当水平的几丁质酶。例如成虫在非蜕皮期过量表达几丁质酶，害虫等几丁质成分会被水解，从而对其造成一定的损伤，致使昆虫无法进行正常的生命周期甚至死亡，人们利用这一原理实施农业治虫高效且环保。punja 等6

50、1指出，虽然转几丁质酶基因可以增强植物的抗病虫的能力，但这与物种、基因来源、类型、导入目标植株后在染色体上的定位及病原菌的种类等均有关系,上述不确定性导致利用导入外源抗病基因来增强植物对真菌性病害的抵抗能力的策略更加复杂。punja 等 61将矮牵牛、烟草和赤小豆的几丁质酶基因分别转入黄瓜中，研究发现转基因黄瓜对丝核菌、链酶菌和葡萄孢菌的抗性并未提高；而在用胡萝卜为材料的转化试验中发现其对同样的病原菌表现出抗性，烟草几丁质酶基因的效果大大优于矮牵牛几丁质酶基因。定向进化可以快速地对蛋白质进行改造，优化蛋白质的某些性质，所以可以利用分子定向进化对水稻几丁质酶改造以提高其本身所具有的酶活力，解决物

51、种、基因来源、类型等对转几丁质酶基因植物发挥其对病虫防御作用的限制。通过几丁质酶的定向进化不仅可以产生有用的酶，而且对几丁质酶结构和功能的研究也具有极重要意义。非理性设计可以快速方便地产生同一种几丁质酶的多种不同突变体，这些突变体所表现出来的性能(酶的活力、特异性和稳定性等)与其对应的氨基酸序列可形成大量的生物信息库。分析这些数据，找出可能对几丁质酶性能影响较大的氨基酸序列，为几丁质酶的理性设计提供理论依据，使理性设计更能11充分发挥其应有的作用，实现对其的改造。为转基因水稻提供研究材料。3 目的基因的体外突变及克隆目的基因的体外突变及克隆3.1 实验材料实验材料3.1.1 菌株菌株 菌种 e

52、.coli（top10f，bl21）本实验室保存。3.1.2 质粒质粒 pbmp-p 质粒及含有水稻几丁质酶基因的（pet28a-chab， ）质粒（本验室保存） 。3.1.3 试剂试剂 pcr 扩增试剂（宝生物公司） 、bamhi/ecori 限制性内切酶(fermentas 公司）、dna marker（宝生物公司） ， dnasei（宝生物公司）,t4 dna 连接酶及rnasea ， （宝生物公司） ，胶回收试剂盒（bioflux 公司） 。琼脂糖:biowest regular溶液 i：50 mmol/l 葡萄糖，25 mmol/l tris-hcl，10 mmol/l edta溶液

53、：5 mol/l naoh，2% sds 按 1：1 体积现配现用溶液：5 mol/l 乙酸钾 60 ml，冰乙酸 11.5 ml，水 28.5 ml rnase 溶液：10 mg/ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） te buffer：10 mmol/l trishcl，1 mmol/l edta，ph 8.0氨苄青霉素：（100 g/ml）12iptg：20 mg/ml，0.22 m 滤膜过滤除菌后于-20贮存备用x-gal：50 mg/ml，用二甲基甲酰胺配制，黑纸包裹后-20贮存3.1.4 主要仪器主要仪器 pcr 仪（bio-rad（s1000） ） ，核酸电泳仪（jy600）

54、 ，紫外透射分析仪（uv-vi） ，凝胶成像系统（美国通用 tmagequant300） ，高速冷冻离心机（biofuge fresco） ，转移脱色摇床（ts-8） ，紫外可见分光光度计（752） ，超净工作台（sw-cj-if） ，隔水式恒温培养箱（gnp-9160）3.2 实验方法实验方法3.2.1 几丁质酶基因突变及筛选文库的构建几丁质酶基因突变及筛选文库的构建3.2.1.1 质粒提取质粒提取将含有水稻几丁质酶基因（chab）的菌种分别经平板划线培养和液体培养后，用碱性裂解法提取质粒。3.2.1.2 水稻几丁质酶基因水稻几丁质酶基因 chab 的扩增的扩增以 a1(5atggtgaac

55、ggctacttgtt 3)，a2（5gatggacgatcagtggttg 3）为引物，质粒 pet28a-chab 为模板进行 pcr 扩增；扩增条件：95预变性 5min，95变性 15s，55退火 1min，72延伸 45s，72延伸 10min，30 个循环。3.2.1.3 目的基因纯化回收目的基因纯化回收利用 bioflux 胶回收试剂盒对 pcr 产物进行纯化，主要步骤如下： 1）用干净锋利的手术刀切下含有目的片段的凝胶部分，并放入 1.5ml 离心管中（注意尽量切去不含 dna 片段的凝胶） ；2）按 1:3 的比例（凝胶的毫克数:融胶液的微升数）向离心管加入extractio

56、n buffer（注意每份试剂的用量不能超过 400mg 的凝胶） ； 3）在恒温水浴或金属浴中 50温浴，直至凝胶完全融化（温浴 10min，一般温浴过程中每隔 2-3min 混匀一次） ；4）将混合液全部转移到 spin column 内，于 6000rpm 离心 1min，弃去接液管内液体（如混合液大于 750l 可先转移 750l，其余的液体待弃液后再转移） ； 5）加 500l extraction buffer 于 spin column 内，13000rpm 离心 60s，并弃去接液管内液体；136）加 750l wash buffer 于 spin column 内，于 130

57、00rpm 离心 60s，去除接液管内液体；7）再次以 13000rpm 的速度离心 1min，然后将 spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中；8）加 30-50l elution buffer、te 溶液或灭菌去离子水于 spin column 内，室温静置 1min（根据实验的实际需要确定 elution buffer 的具体用量，如果长期保存最好用 te。 ） ；9）以 13000rpm 的速度离心 60s，1.5ml 离心管内溶液中含有目的 dna 片段，取适量体积（5l）进行电泳检测，其余放-20 冰箱保存。3.2.2 易错易错 pcr以 p1（5-gat ggg

58、atc cgt gaa cgg cta ctt gtt ccg-3画线处为bamhi 酶切位点）, r1(5-tgc gga att cgt ggt tgg cga cga tct cc-3画线处为 ecori 酶切位点)为引物，纯化的几丁质酶基因 pcr 产物为模板进行易错 pcr；扩增条件：95预变性 5min，94变性 1min，50退火 lmin，72延伸 1.5min，25 个循环，置 4保存 15min。3.2.3 dna 改组改组(dna shuffling)1）基因的片段化将纯化回收的易错 pcr 产物 chab 在 16，8min 条件下进行dnasei随机酶切反应,然后加入

59、 edta 至终浓度为 2.5mm 后，65加热 10 分钟使 dnase i失活.电泳上样缓冲液用 10%的甘油进行稀释,以便于看清低分子量的条带，消化的 dna 片断经 2低熔点琼脂糖凝胶电泳，选取合适大小范围的 dna 片段(50-200bp)，并回收试剂盒回收 dna 片断。2）dna 片段的组装 (无引物 pcr)纯化回收的 dna 片段为模板进行无引物 pcr。扩增条件；95预变性5min，94变性 30s，45退火 1min，72延伸 45s，72延伸 10min，30 个循环。3）无引物 pcr 产物的纯化回收用购自 bioflux 公司的胶回收试剂盒进行回收（按照其说明操作）

60、。4）全长基因的扩增(加引物)以 p1（5-gat ggg atc cgt gaa cgg cta ctt gtt ccg-3画线处为bamhi 酶切位点）, r1(5-tgc gga att cgt ggt tgg cga cga tct cc-3画线处为 ecori 酶切位点)为引物，纯化回收的无引物 pcr 产物为模板进行全14长基因的扩增。扩增条件：95预变性 5min，94变性 30s，58退火45s，72延伸 45s，72延伸 10min，19 个循环。5）全长基因的回收用购自 bioflux 公司的胶回收试剂盒进行回收(按照其说明操作)。3.2.4 突变文库的构建突变文库的构建将